من انا

صورتي
الرياض, Saudi Arabia
مسلم، وأناأحوج ما أكون إلى معرفة نفسي

الثلاثاء، 31 يناير، 2012

الطرق الجزيئية لتحليل المجتمعات الميكروبية


الطرق الجزيئية لتحليل المجتمعات الميكروبية

هنالك (3) أسئلة أساسية توجد عند اكتشاف أو وصف أي نظام بيئي طبيعي أو صناعي وهي كالتالي :

1- ما هي أنواع الأحياء الدقيقة الموجودة ؟

2- ما الضرر أو عمل هذه الأحياء الدقيقة ؟

3- ما هي أنشطة الأحياء الدقيقة المتعلقة بوظائف النظام البيئي ؟

-         هنالك العديد من الطرق أو الأساليب الكيموحيوية والجزيئية التي سبق تطبيقها للكشف عن مركبات المجتمعات الميكروبية على مر الزمان والمكان استجابةً للتغييرات البيئية .





عينات بيئية مثل ( التربة – المياه – الرسوبيات )

مستخلص من الحمض النووي (  دنا  / رنا)  بروتينات ودهون
طرق القواعد الجزيئية

الطرق الجزيئية لتحليل المجتمعات الميكروبية
جزئياُ (partial  )
الطرق الجزيئية لتحليل المجتمعات الميكروبية كاملةً (whole)
تقنية البصمة الوراثية مثل :
(ARDRA , SSCP , T-RFLP ,DGGE , RISA , LH- PCR , RAPD)
Reassociation إعادة ارتباط الـ DNA /RNA
Clone library method
G+C  fractionation)   )  تجزيء
Q-PCR (real-time PCR)
تسلسل جينوم كامل Whole genome Sequencing
FISH, dot-blot hybridization
Metagenomics
Microbial lipid analysis
Metaproteomics
DNA microarrays
Proteogenomics
Microautoradiography and
  Isotope arrayترتيب النظائر
Metatranscriptomics
DNA/RNA Stable isotope probing  التحقق من استقرار النظائر
CARD-FISH,Raman-FISH,NanoSIMS
Functional diversity    الاختلاف الوظيفي
Structural diversity  الاختلاف  التركيبي
Protein diversity الاختلاف البروتيني
Metabolic diversity   الاختلاف الأيضي



ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ

1-  نهج تحليل المجتمع الجزئي        partial community analysis approaches :

·        هذه الإستراتيجية بصفة عامة تتضمن الطريقة الأساسية لتفاعلات الـ PCR .

·        في هذه الطريقة يتم استخدام مجموع الأحماض الأمينيه المستخرجة من عينات بيئية كنموذج لوصف الكائنات الحية الدقيقة .

·        في البداية فإن المنتج الناتج إلى حد ما من توليد الـ PCR  يعكس خليط جيني متوقع من كل الكائنات الموجودة في العينة .

·        تضاعف الـ PCR  للجينات المحفوظة مثل ( 16S rRNA ) من عينة بيئة قد سبق استخدامها على نطاق  واسع في علم البيئة الميكروبي أولاً بسبب أن هذه الجينات :

أ- كليّاً , موجودة في حياة كل الكائنات الحية الدقيقة .

ب- حفظ التركيب والوظيفة .

ج-  تحتوي على مناطق حفظ عالية وكذلك على متغيرات .

·        يتم تحليل الحمض النووي البيئي المضاعف من الـ ( PCR) مبدئياً عن طريق :

1- أسلوب مكتبة  الاستنساخ .

2- البصمة الوراثية .

3- DNA microarray .

أولاُ / طريقة مكتبة الاستنساخ Clone Library Method  :

1- هذا الأسلوب يعتبر الأكثر استخداماً لتحليل مضاعفات الـ ( PCR) للعينات البيئية لاستنساخ ثم تسلسل القطع الجينية الفردية .

2- يتم مقارنة التسلسلات المحرزة مع التسلسلات المعروفة في قاعدة البيانات مثل ( بنك الجينات – مشروع قاعدة البيانات الريبوسومي RDP)) – Greengenes  ).

3- عادة يتم تحديد السلاسل المنسوخة ( الأسرة – الصف – الرتبة – العائلة – تحت عائلة أو النوع ) , كما تكون قيم السلسلة المتشابهه على التوالي ( 80 – 85 – 90 – 92 – 94 - أو 97 % ).

4- بالرغم من عيوب هذه  الطريقة والمتمثلة في ( الجهد العالي – والوقت المستغرق – عامل الكلفة ) إلاّ أنها مازالت تعتبر المعيار الذهبي (gold standard ) لمعاينة التنوع أو الاختلافات الميكروبية الأولية .

(في الشكل التالي يوضح عزل وجمع الـ mRNA  ومن ثم عمل نسخ عكسي ليعطي DNA ثم ادخال في البلازميدات البكتيرية  ثم نمو ثم عزل البلازميدات وتنقية الـ RNA  ثم سلسلة من الـ ( DNA) : ATCCTATCGTAG ……… ).

ثانياً : طريقة تقنية البصمة الوراثية :Genetic Fingerprinting Techniques

1- تعريف البصمة الجينية للمجموعات البكتيرية تستند على أساس التحليل المباشر لمضاعفات الـ PCR من الحمض النووي البيئي .

2- هذه التقنية تتضمن التالي (ARDRA , SSCP , T-RFLP ,DGGE/TGGE , RISA , LH- PCR , RAPD) ) وتبرز البصمة الوراثية للمجتمعات على أساس إما " تسلسل الأشكال المتعددة" أو " طول الأشكال المتعددة " .

3- بصفة عامة تقنية البصمة الوراثية سريعة وتسمح في نفس الوقت بتحليل عينات متعددة .

4- لقد ابتكرت طريقة البصمة الوراثية لإثبات وجود أثر للمجموعة الميكروبية أو الاختلافات بين المجتمعات الميكروبية ولكنها في نفس الوقت لا توفر أي تطبيقات للتصنيف المباشر .

5- يتم مقارنة البصمة الوراثية لعينات مختلفة باستخدام التحاليل العنقودية الحاسوبية المجهزة عن طريق مجموعة برامج مثل ( GelCompar) ويستدل على العلاقات الاجتماعية .

6- فالبصمة الوراثية للمجتمعات هي علامة لوجود أو غياب والتشابه بين العينات ويكون التحديد في ذلك باستخدام معامل Jaccards .

فمن طرق البصمة الوراثية ما يلي :

1- المنحدر الحراري للجل الكهربائي Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE) :

·        الـ ( TGGE)  و ( DGGE) هي شكل من أشكال الكهرباء electrophoresis  التي تستخدم إما درجة الحرارة (T) أو المنحدر الكيميائي (D) لمسخ العينة تنقلها عبر الأكرليك أميد الجل .

·        الـ ( TGGE)  و ( DGGE) يمكن تطبيقهما على الأحماض الأمينية مثل ( الدنا و الرنا ) والأقل شيوعاً على البروتينات .

·        الـ ( TGGE)  يعتمد على التغيرات المعتمدة في درجة حرارة التركيب لفصل الأحماض النووية .

·        الـ ( DGGE) هي التقنية الأصل و الـ ( TGGE)  تم تنقيته منه أو( تكريره منه).

·        الـ ( DNA ) لديها شحنة سالبة وبالتالي سوف تتحرك للقطب الموجب في الحقل الكهربائي .

·        الجل يعتبر شبكة جزيئيات  فيها ثقوب لها نفس حجم قطر خيط الحمض النووي (DNA).

·        عندما يتم نشر الحقل الكهربائي فإن الحمض النووي (الدنا) سوف يبدأ في التحرك خلال الجل بسرعة تناسب طول جزيء الـ DNA  " وعلى هذا الأساس فالفصل يتوقف على الحجم في المعيار الكهربائي .

·        ومن ناحية  فإن الـ ( TGGE)  يكون فيه منحدر أو تدرج حراري عبر الجل .

·        يوجد الحمض النووي الدنا (دبل الخيط) في حالة استقرار وثبات عند درجة حرارة الغرفة  , وعند زيادة درجة الحرارة فإن الخيط يبدأ بالانفصال (يذوب) والسرعة التي تكون من خلال الجل سوف تنخفض بشكل قوي .

·        هذه الزيادة في درجة الحرارة (حرارة الانفصال) تعتمد على السلسلة (زوجين من القواعد النيتروجينية (GC) يكون أكثر استقرارا مقارنة بـ (AT) حيث يوجد هنالك (3) روابط هيدروجينية بين (GC) بينما يوجد رابطتين  هيدروجينية فقط بين (AT) , وبالتالي فإن TGGE يجهز بـ " سلسلة تتابع وطريقة القياس المستقل " لفصل جزيئات الحمض النووي الدنا .

·        TGGE ليس فقط لفصل الجزيئات وإنما يعطي معلومات إضافية حول سلوك الانصهار أو الذوبان والاستقرار .

 2- المسخ المتدرج للجل الكهربائي Denaturing  Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) :

·        في DGGE   نجد الـ PCR يكون الحمض النووي الدنا السائد استخدم كبريمرز  كعلامة محددة للجزيئات مثل ( 16S rRNA gene) , والكهربا على جل polyacrylamide يحتوي على منحدر خطي من مسخ الحمض النووي دنا  مثل خليط من اليوريا شكل من الوسط البيئي (ميديا).

·        فـ DGGE  يعمل بواسطة تطبيق عينات صغيرة من دنا / رنا إلى الهلام الكهربائي الذي يحتوي على عامل مسخ .

·        وقد وجد الباحثون أن هنالك هلام مسخ محدد قادر على حمل الحمض النووي دنا ليذوب في مراحل مختلفة

·        وكنتيجة لهذا الذوبان فالحمض النووي دنا يمتد خلال الجل (الهلام) و يستطيع أن يحلل مركب واحد حتى تلك التي لها قواعد زوجية صغيرة (200 – 700).

·        الشيء الفريد أو الوحيد لهذه التقنية هو أن الحمض النووي يخضع لزيادة مفرطة في حالات المسخ  , وقطع من الخيوط ذابت تماماَ داخل الخيوط المفردة .

·        عمليات المسخ على جل المسخ تكون حادة جداَ : وفي الواقع الجزيء الذائب في الزمام المنزلق مستمر – وعلى نفس المنوال – معظم القطع الذائبة تكون في عملية الخطوة الذكية .

·        البروتين أو المجال المنفصل من القطع  فجأة تصبح خيوط مفردة داخل مدى ضيق جداَ من حالات المسخ,

·        هذا يجعل من الممكن تمييز الاختلافات في تسلسل الحمض النووي دنا أو طفرات الجينات المختلفة :

-         الاختلافات في تسلسل القطع ذات نفس الطول غالباَ ما يسبب الإذابة الجزيئية لمواقع مختلفة  في التدرج ولذلك تقف على مواقع مختلفة في الهلام .

-         عن طريق مقارنة سلوك الذوبان لقطع الحمض النووي دنا جنباَ إلى جنب على منحدر الجل ( الهلام) المسوخ , ذلك يستطيع كشف القطع التي تملك طفرات في حقل الذوبان الأول .

-         وضع عينتين جنباَ إلى جنب على الهلام (الجل) والسماح لهم بالمسخ مع بعضهما ذلك جعل الباحثون باستطاعتهم بسهولة رؤية حتى الاختلافات الصغيرة في العينتين أو غي قطع الحمض النووي دنا .

·        هنالك العديد من العيوب لهذه التقنية  :

-         لا يمكن نسخ المسخ الكيماوي المستخدمة في هذه التقنية .

-         كما أنه من الصعوبة تحديده , وغالباَ لا يمكن تحليله أو تصميمه كاملاَ. Heteroduplexes .

·        معالجة تلك المشاكل :

-         يكون بواسطة TGGE  التي تستخدم درجة الحرارة كحل أحرى من الكيميائية .

-         التدرج في مسخ العينة .


هناك تعليق واحد:

R. am. يقول...

السلام عليكم استاذ فهد , ممكن تطلعني على مصادر هذه المدونة او المصادر المهمة اللي ممكن القى فيها العناوين الاساسية , وشكرا