من انا

صورتي
الرياض, Saudi Arabia
مسلم، وأناأحوج ما أكون إلى معرفة نفسي

الثلاثاء، 31 يناير، 2012

المكافحة الحيوية لفطر الكانديدا البيكانز المسبب لإصابات الفم




المكافحة الحيوية لفطر الكانديدا البيكانز المسبب لإصابات الفم

Biocontrol of Candida albicans Causing Oral Infections









  مقدم من

فهد بن عبدالله ال ضبعا ن 



          





















ملخص البحث Abstract

ابتدأ البحث بجمع 50 عزلة من فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans من مستشفى الملك فيصل التخصصي بوسط الرياض، والتي تم عزلها من لعاب 30 حالة مرضية و 20 حالة لا تظهر عليها أعراض المرض. تم زرع هذا الفطر الممرض على بيئة السباروود جلوكوز آجار حتى يستعيد نشاطه وحيويته. ثم تم التأكد من كون هذا الفطر كانديدا البيكانز Candida albicans بإجراء اختبارات النشاط الانزيمى المرتبط بوجود هذا الفطر بشكل متفاوت مثل الإنزيم المحلل للبروتين proteinase، الإنزيم المحلل للدهون المفسفرة phospholipase، الإنزيم المحلل لبروتين الكولاجين collagenase، الإنزيم المحلل لحامض الهيالورونيك hyaluronidase، الإنزيم المحلل لكبريتات الكوندروتين  chondroitin sulphatase. فوجد أن 25 عزلة لهم القدرة على إفراز الخمس انزيمات السابق ذكرها، 15 عزلة لها القدرة على إفراز الإنزيم المحلل للبروتين proteinase، الإنزيم المحلل للدهون المفسفرة phospholipase، والإنزيم المحلل لبروتين الكولاجين collagenase ولكن غير قادرين على إفراز الإنزيم المحلل لحامض الهيالورونيك hyaluronidase و الإنزيم المحلل لكبريتات الكوندروتين  chondroitin sulphatase و 10 عزلات لها المقدرة على إفراز الإنزيم المحلل للبروتين proteinase فقط. وعلى الجانب الآخر تم جمع عينات تربة زراعية من مناطق مختلفة بمدينة الرياض حيث تم عزل 120 عزلة أكتينوميسيتية منها. تم عمل اختبار الحساسية لعزلات فطر الكانديدا البيكانز ضد عزلات الأكتينوميسيتات، فكان هناك 100 عزلة أكتينوميسيتية لها نشاط مضاد لهذا الفطر الممرض ولكن بكيفيات مختلفة؛ حيث وجد أن 40 عزلة أكتينوميسيتية ثبطت نمو الـ 25 عزلة لفطر الكانديدا البيكانز Candida albicans المفرزة للخمس انزيمات الذين ذكروا آنفا ولكن لم يكن لهم تأثير على باقي عزلات الفطر، 35 عزلة أكتينوميسيتية استطاعت أن تثبط الـ 15 عزلة لفطر الكانديدا البيكانز Candida albicans المفرزة للإنزيم المحلل للبروتين proteinase، الإنزيم المحلل للدهون المفسفرة phospholipase، والإنزيم المحلل لبروتين الكولاجين collagenase، 25 عزلة أكتينوميسيتية استطاعت أن تثبط الـ 10 عزلات لفطر الكانديدا البيكانز Candida albicans  المفرزة  للإنزيم المحلل للبروتين proteinase فقط. وقد تم تحديد أقوى ثلاث عزلات أكتينوميسيتية واحدة من كل مجموعة و يرمز لهم A-10، A-25، A-72 على التوالي، ثم تم تعريفهم تعريفا مبدئيا باستخدام الصفات الظاهرية والمزرعية والفسيولوجية فوجد أن الثلاث عزلات تتبع جنس الأستربتوميسس Streptomyces . وعلى ضوء ما سبق آنفا تم إعطاء رقم كودي لكل عزلة من الأستربتوميسس Streptomyces للتمييز؛ حيث كانت A-10 هي استربتوميسس-1 Streptomyces-1 ، A-25 هي استربتوميسس-2 Streptomyces-2 ، A-72 هي استربتوميسس--33 . Streptomyces







 مقدمة البحث Introduction

            إن ضراوة فطر الكانديدا البيكانز تكون مصحوبة بإفراز بعض الإنزيمات مثل الإنزيم المحلل للبروتين proteinase، الإنزيم المحلل للدهون المفسفرة phospholipase، الإنزيم المحلل لبروتين الكولاجين collagenase (Wu, et al. 1996).



إن الإنزيم المحلل لحامض الهيالورونيك hyaluronidase و الإنزيم المحلل لكبريتات الكوندروتين  chondroitin sulphatase يوجدان دائما في البكتريا التي تسبب إصابات الفم (Takeuchi, et al. 1982 and Peterson, 1992). إن فطر الكانديدا البيكانز يستخدم مكونات نسيج اللثة مثل حامض الهيالورونيك Hyaluronic acid و كبريتات الكوندروتين  chondroitin sulphateفي النمو (Cannon, et al. 1995 and Barga, et al. 1996).

           

ارتباط فطر الكانديدا البيكانز بالخلايا الطلائية يثبط بواسطة إفراز الإنزيمات المحللة للروابط الجليكوسيدية Glycosidic bonds الموجودة في الجدار الخلوي لهذا الفطر وتسمى انزيمات Glycosidases (Douglas, 1986 and Darwezeh, et al. 1997). إن ارتباط فطر الكانديدا البيكانز بالخلايا الطلائية يعتبر خطوة أولى في النمو وعمل المستعمرات وإحداث إصابات ذات أعراض وإصابات ليس لها أعراض Symptomatic and Asymptomatic Infections في الغشاء المخاطي للتجويف الفمى (Barga, et al. 1995).

           

إن الالتهابات التي يحدثها فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans في التجويف البلعومى الفمى والتي تعالج باستخدام الفلوكونازول fluconazole يلاحظ تواجدها بكثرة في مرضى الايدز وخصوصا بعد استخدام هذا العقار فترة طويلة في العلاج (maenza, et al. 1997)



إن فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans يسبب إصابات الأغشية المخاطية والجلد والتي تشمل التهابات التجويف البلعومى الفمى، كما أن أغلب الإصابات المتتابعة الانتهازية لهذا الفطر تكون دائما بين مرضى الايدز (Klein, et al. 1984 and Feigal, et al. 1991)



            إن استخدام الأدوية المضادة لهذا الفطر والتي تحتوى على حلقة الأزول azole تكون فعالة في علاج التهابات التجويف البلعومى الفمى ولكن تكرار استخدامها ولمدة طويلة في العلاج يؤدى إلى اكتساب مقاومة ضدها من قبل الفطر الممرض وبالتالي تخفق هذه الأدوية في علاج هذا الفطر الممرض. وقد ذكر انه منذ عقدين كان فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans قليل إحداث الإصابة للإنسان ولكن نظرا لاكتسابه مقاومة ضد الأدوية المستخدمة في علاجه أصبح في السنوات الأخيرة أكثر الفطريات إصابة للإنسان (Michael and D. pharm, 2001).

إن الإصابات المتتابعة لفطر الكانديدا البيكانز Candida albicans والتي تتزايد بشكل مطرد مع اكتسابه مقاومة ضد الأدوية المستخدمة في علاجه جعل هذا الفطر هو محل اهتمام البحوث العلمية في جميع أنحاء العالم (Goff, et al. 1995 and Nolte, et al. 1997) .



            وقد ذكر العالم Kieren, et al. 1998 أن فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans المقاوم لدواء فلوكونازول fluconazole والمسبب للالتهابات التجويف البلعومى الفمى لمرضى الايدز ظهر حديثا أنه يسبب التهابات حادة لمرضى السرطان المتلقون لعلاج الكيماوي وخصوصا مع مرضى سرطان الدم اللذين ينقل لهم نخاع سليم.



هناك عدة دراسات أثبتت أن عزلات فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans أصبحت مقاومة لكل من الفلوكونازول fluconazole و الأمفوتريسين ب Amphotericin B بعد أسبوعين من تناولهما. وكما هو المعروف طبيا أن العلاج المضاد للميكروبات يستخدم فقط أثناء الأزمة المرضية وذلك للتنامي السريع للمقاومة التي يكتسبها الميكروب ضد هذا العلاج                                            (Anonyymous, 2001)



           وفى هذا المضمار يكون البحث عن أدوية جديدة لعلاج هذا الفطر الممرض احتياج عام وضروري وله أولوية قصوى. إن الأكتينوميسيتات هي واحد من أكثر المصادر الفعالة والقوية لإنتاج أنواع مختلفة من المواد الأيضية مثال المواد المضادة للفطريات والمواد المضادة للبكتريا. الأنواع المختلفة من جنس الأستربتوميسس Streptomyces spp هي مصدر الغالبية العظمى للمضادات الحيوية المحطمة للجراثيم الفطرية التي تسبب أمراض النبات والحيوان والإنسان                (El-Tarabily, et al. 1997 and Kieser, et al. 2000)           

              وفى أحد الأبحاث التي اهتمت بإيجاد مواد مضادة لفطر الكانديدا البيكانز Candida albicans تم عزل 50 عزلة أكتينوميسيتية من التربة الزراعية،  ثم تم اختبار قدرتهم على تضاد هذا الفطر الممرض فوجد أن أقوى عزلة هي سلالة استربتوميسس أوليفاشيس Streptomyces olivaceus التي لها نشاط مضاد قوى وفعال ضد هذا الفطر الممرض                      (Shahrokhi, et al. 2005 and Shaffi, et al. 2005)           

             من أهم الفطريات الممرضة للإنسان هو فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans والذي يعالج بواسطة المضادات الحيوية البولينية polyene antibiotics التي ينتجها جنس الأستربتوميسس (Hay, 2003). ومن أهم المضادات الحيوية البولينية  الأمفوتريسين ب Amphotericin B، النيستاتين Nystatin و الناتاميسين Natamycin، ولكن نظرا لظاهرة المقاومة للمضادات الحيوية والتي انتشرت بشكل كبير في السنوات الأخيرة كان اهتمام البحث العلمي منصبا حول إيجاد مضادات حيوية فعالة جديدة (Guple, et al. 2002; Iznaga, et al. 2004; Augustine, et al. 2005 and Gohel, et al. 2006)  







الطرق والمواد المستخدمة Materials and Methods

جمع عزلات فطر الكانديدا البيكانز Collection of Candida albicans isolates

            تم جمع عزلات فطر الكانديدا البيكانز  Candida albicans من حالات مرضية بمستشفى الملك فيصل التخصصي بوسط الرياض بعضها مصاب بالتهابات حادة في الأغشية المخاطية واللثة بالتجويف الفمى، والبعض الآخر لم يظهر عليه أعراض مرض فطر الكانديدا البيكانز  Candida albicans ولكن كانت الحالات تعانى من أمراض صدرية مختلفة وبأخذ عينات من البصاق والتعرف على الكائنات الدقيقة الممرضة بها وجد فطر الكانديدا البيكانز  Candida albicans بجانب كائنات دقيقة أخرى. تم تعريف عزلات فطر الكانديدا البيكانز من قبل فريق العمل البحثي بالمستشفى السبق ذكرها.

البيئات المستخدمة Media

1-     سباروود جلوكوز آجار Sabouraud glucose agar

 بيئة جاهزة من إنتاج شركة دفكو Difco.

2-     الآجار المغذى Nutrient agar

بيئة جاهزة من إنتاج شركة دفكو Difco.

3-     نشا – نترات آجار Starch nitrate agar (Waksman, 1961)

·         نشا (20 جم)

·         نترات البوتاسيوم (2 جم)

·         كربونات الكالسيوم (3 جم)

·         فوسفات البوتاسيوم ثنائي الهيدروجين (1 جم)

·         كلوريد الصوديوم (0.5 جم)

·         كبريتات الماغنيسيوم المائية (0.5 جم)

·         الآجار (20 جم)

·         ماء الصنبور (1 لتر)

·         الرقم الهيدروجيني 7.2

4-     آجار مستخلص الخميرة والشعير Yeast-Malt extract agar (Pridham, et al. 1957)

·         مستخلص الخميرة (4 جم)

·         مستخلص الشعير (10 جم)

·         جلوكوز (4 جم)

·         الآجار (20 جم)

·         ماء مقطر (1 لتر)

·         الرقم الهيدروجيني 7.2



5-     مرق مستخلص الخميرة والتربتون Tryptone yeast extract broth (Pridham and Gottlieb, 1948)

·         تربتون (5 جم)

·         مستخلص الخميرة (3 جم)

·         الآجار (20 جم)

·         ماء مقطر (1 لتر)

·         الرقم الهيدروجيني 7.2

6-     آجار مستخلص الشوفان Malt extract agar (Kuster, 1959a)

·         شوفان (20 جم)

·         آجار (20 جم)

·         الرقم الهيدروجيني 7.2

7- نشا – أملاح غير عضوية آجار   Inorganic salt starch agar (Kuster, 1959b)

  • نشا (10 جم)
  • كبريتات الماغنيسيوم المائية (1 جم)
  • كلوريد الصوديوم (1 جم)
  • كربونات الكالسيوم (2 جم)
  • كبريتات الأمونيوم (2 جم)
  • فوسفات ثنائي البوتاسيوم و الهيدروجين (1 جم)
  • الآجار (20 جم)
  • ماء مقطر (1 لتر)
  • الرقم الهيدروجيني 7.2

8- جليسرول أسباراجين آجار Glycerol asparagine agar (Pridham and Lyons, 1961)

·         جليسرول (10 جم)

·         أسباراجين (10 جم)

·         فوسفات ثنائي البوتاسيوم و الهيدروجين (1 جم)

·         الآجار (20 جم)

·         ماء مقطر (1 لتر)

·         الرقم الهيدروجيني 7.2

9-     مستخلص الخميرة – الببتون – الحديد آجار Peptone yeast extract iron agar (ISP)

·                                 بيبتون (20 جم)

·                                 خلات حديديك الأمونيوم (0.5 جم)

·                                 فوسفات ثنائي البوتاسيوم و الهيدروجين (1 جم)

·                                 كبريتات الصوديوم (0.08 جم)

·                                 مستخلص الخميرة (1 جم)

·                                 الآجار (20 جم)

·                                 ماء مقطر (1 لتر)

·                                 الرقم الهيدروجيني 7.2

10- تيروسين آجار Tyrosine agar (Gordon and Horan, 1974)

  • مستخلص اللحم (3 جم)
  • بيبتون (5 جم)
  • كلوريد الصوديوم (5 جم)
  • تيروسين (5 جم)
  • الآجار (20 جم)
  • ماء مقطر (1 لتر)
  • الرقم الهيدروجيني 7.2

11- البيئة الأساسية آجار Basic agar  (Kuster, 1959a)

  • سككاروز (2 جم)
  • نترات الصوديوم (0.3 جم)
  • فوسفات الماغنيسيوم (0.05 جم)
  • كلوريد البوتاسيوم (0.05 جم)
  • كبريتات الحديدوز (0.001 جم)
  • آجار (1.5 جم)
  • ماء صنبور (100 مل)
  • الرقم الهيدروجيني 5.6



طريقة تحضير البيئات الجاهزة Preparation of packaged media

            تم إتباع الخطوات المذكورة على العبوة، حيث تم وزن البيئة حسب ما ذكر وإذابتها في الماء المقطر (1 لتر) ثم وضعها على السخان ذو المقلب الممغنط حتى امتزجت تماما بشكل متجانس. تم تعقيم البيئات باستخدام جهاز الأوتوكلاف (121 درجة مئوية – 1.5 ضغط جوى – 20 دقيقة).



طريقة تحضير البيئات المركبة Preparation of composed media

تم وزن مكونات البيئة باستخدام الميزان الحساس حسب ما ذكر سابقا، ثم إذابة هذه المكونات في الماء المقطر (1 لتر)، ثم وضعها على السخان ذو المقلب الممغنط حتى امتزجت تماما بشكل متجانس. تم تعقيم البيئات باستخدام جهاز الأوتوكلاف (121 درجة مئوية – 1.5 ضغط جوى – 20 دقيقة).



اختبارات النشاط الانزيمى  Enzymatic activity tests (Price, et al. 1982)

1-     اختبار الإنزيم المحلل لحامض الهيالورونيك Hyaluronidase test

تم تحضير البيئة الأساسية آجار Basic agar medium حسب المكونات المذكورة سابقا، تم تعقيم البيئة باستخدام جهاز الأوتوكلاف، تم تحضير محلول هيالورونات الصوديوم للحبل السري للإنسان بتركيز 2 مجم/مل (شركة سيجما للكيماويات الولايات المتحدة الأمريكية) 2 mg/ml of human umbilical cord sodium hyaluronate وتم تعقيمه باستخدام مرشح سيتز Seitz filter. تم إضافة هذا المحلول إلى البيئة بعد تبريدها إلى 45 درجة مئوية، مزج الخليط جيدا ثم صب في أطباق بتري وترك حتى التصلب. تم حقن الأطباق بعزلات فطر الكانديدا البيكانز  Candida albicans ثم تحضين الأطباق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام. بعد انتهاء فترة التحضين غمرت الأطباق بحامض الخليك (2 نورمال) وتركت لمدة 10 دقائق. إذا كانت العزلة مفرزة لهذا الإنزيم سوف تظهر منطقة رائقة حول نمو فطر  الكانديدا البيكانز  Candida albicans. وفى حالة ظهور المنطقة الرائقة يتم قياس قطرها [(قطر المنطقة الرائقة + قطر قرص الفطر)-(قطر قرص الفطر)].



2-     اختبار الإنزيم المحلل لكبريتات الكوندروتين    Chondroitin sulphatase test

تم تحضير البيئة الأساسية آجار Basic agar medium حسب المكونات المذكورة سابقا، تم تعقيم البيئة باستخدام جهاز الأوتوكلاف، تم تحضير محلول كبريتات الكوندروتين لترقية البقر نوع أ 4 مجم/مل (شركة سيجما للكيماويات الولايات المتحدة الأمريكية) 4 mg/ml of bovine trachea chondroitin sulphate type A وتم تعقيمه باستخدام مرشح سيتز Seitz filter. تم إضافة هذا المحلول إلى البيئة بعد تبريدها إلى 45 درجة مئوية، مزج الخليط جيدا ثم صب في أطباق بتري وترك حتى التصلب. تم حقن الأطباق بعزلات فطر الكانديدا البيكانز  Candida albicans ثم تحضين الأطباق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام. بعد انتهاء فترة التحضين غمرت الأطباق بحامض الخليك (2 نورمال) وتركت لمدة 10 دقائق. إذا كانت العزلة مفرزة لهذا الإنزيم سوف تظهر منطقة رائقة حول نمو فطر  الكانديدا البيكانز  Candida albicans. وفى حالة ظهور المنطقة الرائقة يتم قياس قطرها [(قطر المنطقة الرائقة + قطر قرص الفطر)-(قطر قرص الفطر)].



3-     اختبار الإنزيم المحلل للبروتين    Proteinase test

تم تحضير بيئة سباروود جلوكوز آجار Sabouraud glucose agar medium  حسب المكونات المذكورة سابقا، تم تعقيم البيئة باستخدام جهاز الأوتوكلاف، تم تحضير محلول زلال البقر (نوع 5) بتركيز 5%  Bovine albumin fraction V 5 % (شركة سيجما للكيماويات الولايات المتحدة الأمريكية) 5 % bovine albumin وتم تعقيمه باستخدام مرشح سيتز Seitz filter. تم إضافة هذا المحلول إلى البيئة بعد تبريدها إلى 45 درجة مئوية، مزج الخليط جيدا ثم صب في أطباق بتري وترك حتى التصلب. تم حقن الأطباق بعزلات فطر الكانديدا البيكانز  Candida albicans ثم تحضين الأطباق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام. بعد انتهاء فترة التحضين غمرت الأطباق بحامض الخليك (2 نورمال) وتركت لمدة 10 دقائق. إذا كانت العزلة مفرزة لهذا الإنزيم سوف تظهر منطقة رائقة حول نمو فطر  الكانديدا البيكانز  Candida albicans. وفى حالة ظهور المنطقة الرائقة يتم قياس قطرها [(قطر المنطقة الرائقة + قطر قرص الفطر)-(قطر قرص الفطر)].



4-     اختبار الإنزيم المحلل للدهون المفسفرة    Phospholipase test

تم تحضير بيئة سباروود جلوكوز آجار Sabouraud glucose agar medium  حسب المكونات المذكورة سابقا، تم تعقيم البيئة باستخدام جهاز الأوتوكلاف، تم تحضير محلول الدهون المفسفرة بتركيز 3%  Phospholipids 3 % (شركة سيجما للكيماويات الولايات المتحدة الأمريكية) 3 % Phospholipids وتم تعقيمه باستخدام مرشح سيتز Seitz filter. تم إضافة هذا المحلول إلى البيئة بعد تبريدها إلى 45 درجة مئوية، مزج الخليط جيدا ثم صب في أطباق بتري وترك حتى التصلب. تم حقن الأطباق بعزلات فطر الكانديدا البيكانز  Candida albicans ثم تحضين الأطباق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام. بعد انتهاء فترة التحضين غمرت الأطباق بحامض الخليك (2 نورمال) وتركت لمدة 10 دقائق. إذا كانت العزلة مفرزة لهذا الإنزيم سوف تظهر منطقة رائقة حول نمو فطر  الكانديدا البيكانز  Candida albicans. وفى حالة ظهور المنطقة الرائقة يتم قياس قطرها [(قطر المنطقة الرائقة + قطر قرص الفطر)-(قطر قرص الفطر)].



5-     اختبار الإنزيم المحلل للكولاجين    Collagenase test

تم تحضير بيئة سباروود جلوكوز آجار Sabouraud glucose agar medium  حسب المكونات المذكورة سابقا، تم تعقيم البيئة باستخدام جهاز الأوتوكلاف، تم تحضير محلول الكولاجين بتركيز 1%  Collagen 1% (شركة سيجما للكيماويات الولايات المتحدة الأمريكية) 1 % Collagen وتم تعقيمه باستخدام مرشح سيتز Seitz filter. تم إضافة هذا المحلول إلى البيئة بعد تبريدها إلى 45 درجة مئوية، مزج الخليط جيدا ثم صب في أطباق بتري وترك حتى التصلب. تم حقن الأطباق بعزلات فطر الكانديدا البيكانز  Candida albicans ثم تحضين الأطباق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام. بعد انتهاء فترة التحضين غمرت الأطباق بحامض الخليك (2 نورمال) وتركت لمدة 10 دقائق. إذا كانت العزلة مفرزة لهذا الإنزيم سوف تظهر منطقة رائقة حول نمو فطر  الكانديدا البيكانز  Candida albicans. وفى حالة ظهور المنطقة الرائقة يتم قياس قطرها [(قطر المنطقة الرائقة + قطر قرص الفطر)-(قطر قرص الفطر)].



عزل الأكتينوميسيتات من التربة الزراعية Isolation of actinomycetes from soil

لقد تم عزل الأكتينوميسيتات من التربة الزراعية باستخدام طريقة التخفيف المتتابع serial dilution method طبقا للمرجع (Johnson, et al. 1959). تم عمل مستخلص التربة وذلك بوضع 100 جم من التربة الزراعية في 1000 مل ماء مقطر ومعقم مع الرج الشديد. تم تحضير عشرة أنابيب زجاجية تحتوى كل واحدة على 9 مل ماء مقطر ومعقم، تم أخذ 1 مل من مستخلص التربة الزراعية ووضعه في الأنبوبة الأولى ليصبح التخفيف 10-1 ثم أخذ من التخفيف السابق 1 مل ووضع في الأنبوبة الثانية ليصبح التخفيف 10-2 وهكذا حتى نصل إلى التخفيف 10-10. سحب من مستخلص التربة الزراعية ومن كل تخفيف 1 مل ووضع على سطح بيئة نشا-نترات آجار وفرد جيدا باستخدام الفارد المعقم sterilized spreader ووضعت الأطباق في الحضانة في وضع مقلوب لمدة 7 أيام. بعد انتهاء فترة التحضين وبعد فحص الأطباق وظهور مستعمرات مبعثرة على سطح الآجار تم التقاط كل مستعمرة على حده في طبق مستقل يحتوى على نفس البيئة حيث زرعت بطرقة التخطيط على سطح الآجار streaking ثم وضعت في الحضانة لمدة 7 أيام حتى تم الحصول على مزارع نقية.



اختبار الحساسية Sensitivity test (Shahrokhi, et al. 2005)

 تم تحضير أطباق من بيئة سباروود جلوكوز آجار المحتوية على حقنة من فطر الكانديدا البيكانز  Candida albicans والتي تسمى حينئذ بالأطباق المبذورة seeded plates. وضع على سطح الآجار في هذه الأطباق أقراص عزلات الأكتينوميسيتات بشكل منتظم ومتباعد (2 قرص في طبق قطره 9 سم) وكان عمر هذه العزلات 7 أيام. تم وضع الأطباق في الحضانة لمدة 4 أيام ثم فحصت بعد انتهاء فترة الحضانة. ظهور المنطقة الرائقة حول قرص عزلة الأكتينوميسيتات يعنى قدرة هذه العزلة على تثبيط نمو فطر الكانديدا البيكانز  Candida albicans.

تعريف العزلات الأكتينوميسيتية Identification of actinomycete isolates

تم تعريف أقوى العزلات الأكتينوميسيتية المسئولة عن تثبيط فطر الكانديدا البيكانز  Candida albicans بشكل مبدأي طبقا للمرجع الدولي Shirling and Gottlieb, 1966 حيث اعتمد التعريف على الصفات المزرعية cultural characteristics والصفات المورفولوجية Morphological characteristics والصفات الفسيولوجية physiological characteristics.



أولاً: الصفات المزرعية Cultural characteristics

تم زرع عزلات الأكتينوميسيتات على سبع بيئات متخصصة في نمو جنس الأستربتوميسس وإظهار صابغاته إن وجدت، وهى بيئة آجار مستخلص الخميرة والشعير Yeast-Malt extract agar، مرق مستخلص الخميرة والتربتون Tryptone yeast extract broth، آجار مستخلص الشوفان Malt extract agar، نشا – أملاح غير عضوية آجار   Inorganic salt starch agar، جليسرول أسباراجين آجار Glycerol asparagine agar، مستخلص الخميرة – الببتون – الحديد آجار Peptone yeast extract iron agar و تيروسين آجار Tyrosine agar وهى البيئات الموصى بها في المرجع الدولي لمشروع الأستربتوميسس International Streptomyces Project (ISP). تم تحضين جميع الأطباق مع السبع بيئات المذكورة آنفا عند 28 درجة مئوية لمدة 21 يوم ثم تم تحديد لون الخيوط الهوائية aerial mycelia والخيوط الأرضية substrate mycelia ولون الصبغة المنتشرة diffused pigments في الآجار لكل عزلة باستخدام دليل الألوان color index.



ثانياً: الصفات الظاهرية Morphological characteristics

تم زرع عزلات الأكتينوميسيتات على بيئة نشا-نترات الآجار ثم وضعت في الحضانة لمدة 7 أيام، تم تصوير الخيوط الهوائية aerial mycelia لكل عزلة باستخدام المجهر الالكتروني الماسح للتعرف على شكل الجرثومة والخيط.



ثالثاً: الصفات الفسيولوجية Physiological characteristics

1-     اختبار الإنزيم المحلل للنشا Amylase test

تم تحضير بيئة نشا-نترات آجار Starch nitrate agar ، تم تعقيم البيئة وصبها في أطباق بتري وتركت حتى التصلب ثم زرعت بعزلات الأكتينوميسيتات ووضعت في الحضانة لمدة 7 أيام وبعد انتهاء فترة الحضانة غمر الطبق بمحلول اليود. ظهور المنطقة الرائقة حول نمو العزلة الأكتينوميسيتية ويحيطها اللون الأزرق دلالة على تحليل النشا بفعل إنزيم الأميليز amylase بينما اللون الأزرق المحيط بها دلالة على وجود النشا التي لم يتم تحليلها بعد.







2-     اختبار الإنزيم المحلل للبروتين Proteinase test

تم تحضير بيئة نشا-نترات آجار Starch nitrate agar مع استبدال زلال البقر بنترات البوتاسيوم كمصدر للنيتروجين ، تم تعقيم البيئة وصبها في أطباق بتري وتركت حتى التصلب ثم زرعت بعزلات الأكتينوميسيتات ووضعت في الحضانة لمدة 7 أيام وبعد انتهاء فترة الحضانة غمر الطبق بحامض الخليك (20 %). ظهور المنطقة الرائقة حول نمو العزلة الأكتينوميسيتية ويحيطها العكارة دلالة على تحليل البروتين بفعل إنزيم البروتينيز proteinase بينما العكارة المحيطة بها دلالة على وجود البروتين الذي لم يتم تحليله بعد.



3-     اختبار الإنزيم المحلل للدهون Lipase test

تم تحضير بيئة نشا-نترات آجار Starch nitrate agar مع استبدال ثلاثي البيوترين بالنشا كمصدر للكربون ، تم تعقيم البيئة وصبها في أطباق بتري وتركت حتى التصلب ثم زرعت بعزلات الأكتينوميسيتات ووضعت في الحضانة لمدة 7 أيام وبعد انتهاء فترة الحضانة غمر الطبق بحامض الخليك (20 %). ظهور المنطقة الرائقة حول نمو العزلة الأكتينوميسيتية ويحيطها العكارة دلالة على تحليل الدهون (ثلاثي البيوترين) بفعل إنزيم الليبيز lipase بينما العكارة المحيطة بها دلالة على وجود الدهون التي لم يتم تحليلها بعد.



4-     اختبار الإنزيم المحلل للسيليلوز Cellulase test

تم تحضير بيئة نشا-نترات آجار  Starch nitrate agar، مع استبدال السيليلوز بالنشا كمصدر للكربون  تم تعقيم البيئة وصبها في أطباق بتري وتركت حتى التصلب ثم زرعت بعزلات الأكتينوميسيتات ووضعت في الحضانة لمدة 7 أيام وبعد انتهاء فترة الحضانة غمر الطبق بمحلول اليود. ظهور المنطقة الرائقة حول نمو العزلة الأكتينوميسيتية ويحيطها اللون الأزرق دلالة على تحليل السيليلوز بفعل إنزيم السيلوليز cellulase بينما اللون الأزرق المحيط بها دلالة على وجود السيليلوز الذي لم يتم تحليله بعد.







5-     اختبار الإنزيم المحلل للبكتين Pectinase test

تم تحضير بيئة نشا-نترات آجار  Starch nitrate agar، مع استبدال البكتين بالنشا كمصدر للكربون  تم تعقيم البيئة وصبها في أطباق بتري وتركت حتى التصلب ثم زرعت بعزلات الأكتينوميسيتات ووضعت في الحضانة لمدة 7 أيام وبعد انتهاء فترة الحضانة غمر الطبق بمحلول اليود. ظهور المنطقة الرائقة حول نمو العزلة الأكتينوميسيتية ويحيطها اللون الأزرق دلالة على تحليل البكتين بفعل إنزيم البكتينيز pectinase بينما اللون الأزرق المحيط بها دلالة على وجود البكتين الذي لم يتم تحليله بعد.



6-     اختبار الإنزيم المحلل لماء فوق الأكسجين Catalase test

تم وضع قليل من معلق العزلات الأكتينوميسيتية في محلول ماء فوق الأكسجين hydrogen peroxide H2O2، فكان ظهور الفقاعات الغازية دلالة على إفراز إنزيم الكاتاليز catalase الذي يحلل ماء فوق الأكسجين إلى ماء H2O و أكسجين O2.





7-     اختبار إنتاج صبغة الميلانين Melanoid production test

تم زرع العزلات الأكتينوميسيتية على كل من بيئة مستخلص الخميرة – الببتون – الحديد آجار Peptone yeast extract iron agar و تيروسين آجار Tyrosine agar و مرق مستخلص الخميرة والتربتون Tryptone yeast extract broth وتم تحضينهم لمدة 21 يوم ثم فحصت الأطباق والأنابيب. ظهور اللون الأسود منتشرا في الآجار أو في البيئة السائلة دلالة على إنتاج صبغة الميلانين.



8-     اختبار إنتاج كبريتيد الهيدروجين Hydrogen sulphide production test

تم زرع العزلات الأكتينوميسيتية على بيئة مرق مستخلص الخميرة والتربتون     Tryptone yeast extract broth ووضعت أوراق ترشيح مشبعة بخلات الرصاص بين فوهة الأنابيب والسدادات القطنية التي تغطيها بحيث يكون الطرف المشبع بخلات الرصاص داخل الأنبوبة ولا يمس البيئة السائلة المحقونة بخلايا العزلات الأكتينوميسيتية ثم تم تحضينهم لمدة 21 يوم ثم فحصت الأنابيب. ظهور اللون الأسود على الطرف المشبع بخلات الرصاص لورقة الترشيح يدل على إنتاج كبريتيد الهيدروجين الذي تفاعل مع خلات الرصاص مكونا كبريتيد الرصاص.



النتائج Results

تم جمع 50 عزلة من فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans من مستشفى الملك فيصل التخصصي بوسط الرياض، والتي تم عزلها من لعاب 30 حالة مرضية و 20 حالة لا تظهر عليها أعراض المرض. ثم تم إجراء اختبارات النشاط الانزيمى المرتبط بوجود هذا الفطر بشكل متفاوت مثل الإنزيم المحلل للبروتين proteinase، الإنزيم المحلل للدهون المفسفرة phospholipase، الإنزيم المحلل لبروتين الكولاجين collagenase، الإنزيم المحلل لحامض الهيالورونيك hyaluronidase، الإنزيم المحلل لكبريتات الكوندروتين  chondroitin sulphatase. فوجد أن 25 عزلة لهم القدرة على إفراز الخمس انزيمات السابق ذكرها، 15 عزلة لها القدرة على إفراز الإنزيم المحلل للبروتين proteinase، الإنزيم المحلل للدهون المفسفرة phospholipase، والإنزيم المحلل لبروتين الكولاجين collagenase ولكن غير قادرين على إفراز الإنزيم المحلل لحامض الهيالورونيك hyaluronidase و الإنزيم المحلل لكبريتات الكوندروتين  chondroitin sulphatase و 10 عزلات لها المقدرة على إفراز الإنزيم المحلل للبروتين proteinase فقط كما هو موضح بالجدول رقم (1).















جدول (1) اختبار النشاط الانزيمى لعزلات فطر الكانديدا البيكانز  Candida albicans  

Isolate
Enzyme
Pr
Ph
Co
Hy
Ch-S
Ca-1
+
+
+
+
+
Ca-2
+
+
+
+
+
Ca-3
+
+
+
+
+
Ca-4
+
+
+
+
+
Ca-5
+
+
+
-
-
Ca-6
+
+
+
-
-
Ca-7
+
+
+
-
-
Ca-8
+
+
+
+
+
Ca-9
+
+
+
+
+
Ca-10
+
+
+
+
+
Ca-11
+
-
-
-
-
Ca-12
+
-
-
-
-
Ca-13
+
+
+
+
+
Ca-14
+
+
+
+
+
Ca-15
+
+
+
+
+
Ca-16
+
+
+
-
-
Ca-17
+
+
+
-
-
Ca-18
+
+
+
+
+
Ca-19
+
+
+
+
+
Ca-20
+
+
+
-
-
Ca-21
+
-
-
-
-
Ca-22
+
-
-
-
-
Ca-23
+
+
+
+
+
Ca-24
+
+
+
-
-
Ca-25
+
+
+
-
-
Ca-26
+
+
+
+
+
Ca-27
+
+
+
+
+
Ca-28
+
+
+
+
+
Ca-29
+
+
+
-
-
Ca-30
+
+
+
-
-
Ca-31
+
-
-
-
-
Ca-32
+
-
-
-
-
Ca-33
+
+
+
+
+
Ca-34
+
+
+
+
+
Ca-35
+
+
+
+
+
Ca-36
+
+
+
-
-
Ca-37
+
+
+
-
-
Ca-38
+
-
-
-
-
Ca-39
+
+
+
+
+
Ca-40
+
+
+
+
+
Ca-41
+
+
+
+
+
Ca-42
+
+
+
-
-
Ca-43
+
-
-
-
-
Ca-44
+
+
+
+
+
Ca-45
+
+
+
+
+
Ca-46
+
+
+
+
+
Ca-47
+
+
+
-
-
Ca-48
+
+
+
-
-
Ca-49
+
-
-
-
-
Ca-50
+
-
-
-
-

Pr = Proteinase; Ph = Phospholipase; Co = Collagenase; Hy = Hyaluronidase; Ch-S = Chondroitin sulphatase; Ca = Candida; + = activity; - = no activity.



وعلى الجانب الآخر تم جمع عينات تربة زراعية من مناطق مختلفة بمدينة الرياض حيث تم عزل 120 عزلة أكتينوميسيتية منها. تم عمل اختبار الحساسية لعزلات فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans ضد عزلات الأكتينوميسيتات، فكان هناك 100 عزلة أكتينوميسيتية لها نشاط مضاد لهذا الفطر الممرض ولكن بكيفيات مختلفة؛ حيث وجد أن 40 عزلة أكتينوميسيتية ثبطت نمو الـ 25 عزلة لفطر الكانديدا البيكانز Candida albicans المفرزة للخمس انزيمات الذين ذكروا آنفا ولكن لم يكن لهم تأثير على باقي عزلات الفطر، 35 عزلة أكتينوميسيتية استطاعت أن تثبط الـ 15 عزلة لفطر الكانديدا البيكانز Candida albicans المفرزة للإنزيم المحلل للبروتين proteinase، الإنزيم المحلل للدهون المفسفرة phospholipase، والإنزيم المحلل لبروتين الكولاجين collagenase، 25 عزلة أكتينوميسيتية استطاعت أن تثبط الـ 10 عزلات لفطر الكانديدا البيكانز Candida albicans  المفرزة  للإنزيم المحلل للبروتين proteinase فقط. وقد تم تحديد أقوى ثلاث عزلات أكتينوميسيتية واحدة من كل مجموعة و يرمز لهم A-10، A-25، A-72 على التوالي كما هو موضح بالجدول رقم (2).

جدول (2) اختبار الحساسية لعزلات فطر الكانديدا البيكانز ضد عزلات الأكتينوميسيتات

عزلات فطر الكانديدا البيكانز
عدد عزلات الأكتينوميسيتات الفعالة
أقوى عزلة أكتينوميسيتية
Ca-1









40










A-10

Ca-2
Ca-3
Ca-4
Ca-8
Ca-9
Ca-10
Ca-13
Ca-14
Ca-15
Ca-18
Ca-19
Ca-23
Ca-26
Ca-27
Ca-28
Ca-33
Ca-34
Ca-35
Ca-39
Ca-40
Ca-41
Ca-44
Ca-45
Ca-46
Ca-5







35









A-25
Ca-6
Ca-7
Ca-16
Ca-17
Ca-20
Ca-24
Ca-25
Ca-29
Ca-30
Ca-36
Ca-37
Ca-42
Ca-47
Ca-48
Ca-11
25
A-72
Ca-12
Ca-21
Ca-22
Ca-31
Ca-32
Ca-38
Ca-43
Ca-49
Ca-50



تم تعريف العزلات الأكتينوميسيتية الثلاثة A-10، A-25، A-72 تعريفا مبدئيا باستخدام الصفات الظاهرية والمزرعية والفسيولوجية فوجد أن الثلاث عزلات تتبع جنس الأستربتوميسس Streptomyces . وعلى ضوء ما سبق آنفا تم إعطاء رقم كودي لكل عزلة من الأستربتوميسس Streptomyces للتمييز؛ حيث كانت A-10 هي استربتوميسس-1 Streptomyces-1 ، A-25 هي استربتوميسس-2 Streptomyces-2 ، A-72 هي استربتوميسس--33 . Streptomyces



العزلة الأكتينوميسيتية رقم A-10 اتصفت بصفات مزرعية جمعت في جدول رقم (3) أوضح فيه مستوى النمو وألوان الخيوط الهوائية والأرضية والصابغات المنتشرة. كما أوضح الشكل رقم (1) نعومة سطح الجرثومة وشكلها البيضى والشكل الحلزوني للخيط الهوائي. كما اتصفت هذه العزلة بصفات فسيولوجية جمعت في الجدول رقم (4). وبناءً على النتائج التي حصل عليها عرفت هذه العزلة مبدئيا على أنها استربتوميسس وقد أخذت الرقم الكودي 1 فصارت استربتوميسس-1.







جدول (3) الصفات المزرعية للعزلة الأكتينوميسيتية رقم A-10

Medium
Growth
Color of aerial mycelia
Color of substrate mycelia
Color of diffusible pigment
Tryptone yeast extract broth
Poor
264. L. Gray
light gray
79.l.gy.YBr
light gray yellowish brown
No
Yeast extract-malt extract agar
Moderate
10-PK. Gray
pinkish gray
70-l.oy
light orange yellow
No
Oatmeal extract agar
Good
263-L. Gray
light gray
76-l.yBr
light yellowish brown
79-l.gy.YBr
light gray yellowish brown
Inorganic salts starch agar
Moderate
10-PK. Gray
pinkish gray
79-l.gy.YBr
light gray yellowish brown
No
Glycerol asparagine agar
Good
264.L. Gray
light gray
79.l.gy.YBr
light gray yellowish brown
No
Peptone yeast extract iron agar
Poor
10-PK. Gray
pinkish gray
79.l.gy.YBr
light gray yellowish brown
No
Tyrosine agar
Poor
10-PK. Gray
pinkish gray
79.l.gy.YBr
light gray yellowish brown
No




شكل (1) شكل جرثومة وخيط العزلة الأكتينوميسيتية رقم A-10

باستخدام المجهر الالكتروني الماسح



جدول (4) الصفات الفسيولوجية للعزلة الأكتينوميسيتية رقم A-10

الصفة الفسيولوجية
النتيجة
الإنزيم المحلل للنشا amylase
+
الإنزيم المحلل للبروتين proteinase
+
الإنزيم المحلل للدهون lipase
-
الإنزيم المحلل للسيليلوز cellulase
+
الإنزيم المحلل للبكتين pectinase
+
الإنزيم المحلل لماء فوق الأكسجين catalase
-
إنتاج كبريتيد الهيدروجين H2S
-
إنتاج صبغة الميلانين Melanoid pigment
-



العزلة الأكتينوميسيتية رقم A-25 اتصفت بصفات مزرعية جمعت في جدول رقم (5) أوضح فيه مستوى النمو وألوان الخيوط الهوائية والأرضية والصابغات المنتشرة. كما أوضح الشكل رقم (2) تشعر سطح الجرثومة وشكلها البيضى والشكل الحلزوني للخيط الهوائي. كما اتصفت هذه العزلة بصفات فسيولوجية جمعت في الجدول رقم (6).  وبناءً على النتائج التي حصل عليها عرفت هذه العزلة مبدئيا على أنها استربتوميسس وقد أخذت الرقم الكودي 2 فصارت استربتوميسس-2.

جدول (5) الصفات المزرعية للعزلة الأكتينوميسيتية رقم A-25

Medium
Growth
Color of aerial mycelia
Color of substrate mycelia
Color of diffusible pigment
Tryptone yeast extract broth
Good
263. L. Gray
light gray
79.l.gy.YBr
light gray yellowish brown
76-l.yBr
light yellowish brown
Yeast extract-malt extract agar
Poor
263. L. Gray
light gray
90-gy.Y
grayish yellow
No
Oat meal extract agar
Good
263-L. Gray
light gray
60-l.gy.Br
light grayish brown
61-gy.Br
grayish brown
Inorganic- salts starch agar
Poor
10-PK. Gray
pinkish gray
76-l.yBr
light yellowish brown
No
Glycerol asparagine agar
Good
264.L. Gray
light gray
79.l.gy.YBr
light gray yellowish brown
No
Peptone yeast extract iron agar
Moderate
263-White
white
73-p.oy
pall orange yellow
No
Tyrosine agar
Good
9-PK. White
pinkish white
76-l.yBr
light yellowish brown
79-l.gy.yBr
light gray yellowish brown




شكل (2) شكل جرثومة وخيط العزلة الأكتينوميسيتية رقم A-25

باستخدام المجهر الالكتروني الماسح



جدول (6) الصفات الفسيولوجية للعزلة الأكتينوميسيتية رقم A-25

الصفة الفسيولوجية
النتيجة
الإنزيم المحلل للنشا amylase
+
الإنزيم المحلل للبروتين proteinase
+
الإنزيم المحلل للدهون lipase
+
الإنزيم المحلل للسيليلوز cellulase
+
الإنزيم المحلل للبكتين pectinase
-
الإنزيم المحلل لماء فوق الأكسجين catalase
-
إنتاج كبريتيد الهيدروجين H2S
-
إنتاج صبغة الميلانين Melanoid pigment
-

العزلة الأكتينوميسيتية رقم A-72 اتصفت بصفات مزرعية جمعت في جدول رقم (7) أوضح فيه مستوى النمو وألوان الخيوط الهوائية والأرضية والصابغات المنتشرة. كما أوضح الشكل رقم (3) تشعر سطح الجرثومة وشكلها البيضى والشكل الحلزوني للخيط الهوائي. كما اتصفت هذه العزلة بصفات فسيولوجية جمعت في الجدول رقم (8). وبناءً على النتائج التي حصل عليها عرفت هذه العزلة مبدئيا على أنها استربتوميسس وقد أخذت الرقم الكودي 3 فصارت استربتوميسس-3.

جدول (7) الصفات المزرعية للعزلة الأكتينوميسيتية رقم A-72

Medium
Growth
Color of aerial mycelia
Color of substrate mycelia
Color of diffusible pigment
Tryptone yeast extract broth
Poor
263. L. Gray
light gray
 76-l.yBr
light yellowish brown
No
Yeast extract-malt extract agar
Moderate
10-PK. Gray
pinkish gray
73-m oy
moderate orange yellow
No
Oat meal extract agar
Good
263-L. Gray
light gray
76-l.yBr
light yellowish brown
79-lgy.yBr
light gray yellowish brown
Inorganic- salts starch agar
Moderate
10-PK. Gray
pinkish gray
76-l.yBr
light yellowish brown
No
Glycerol asparagine agar
Good
264.L. Gray
light gray
79.l.gy.YBr
light gray yellowish brown
No
Peptone yeast extract iron agar
Poor
10-PK.Gray
pinkish gray
79.l.gy.YBr
light gray yellowish brown
No
Tyrosine agar
Poor
9-PK. White
pinkish white

79.l.gy.YBr
light gray yellowish brown
No




شكل (3) شكل جرثومة وخيط العزلة الأكتينوميسيتية رقم A-72

باستخدام المجهر الالكتروني الماسح



جدول (8) الصفات الفسيولوجية للعزلة الأكتينوميسيتية رقم A-72

الصفة الفسيولوجية
النتيجة
الإنزيم المحلل للنشا amylase
+
الإنزيم المحلل للبروتين proteinase
+
الإنزيم المحلل للدهون lipase
-
الإنزيم المحلل للسيليلوز cellulase
+
الإنزيم المحلل للبكتين pectinase
-
الإنزيم المحلل لماء فوق الأكسجين catalase
-
إنتاج كبريتيد الهيدروجين H2S
-
إنتاج صبغة الميلانين Melanoid pigment
-











المناقشة Discussion

            اهتم هذا البحث بمشكلة منتشرة وسائدة في المجال الطبي في جميع أنحاء العالم، وكان البحث قد تعرض لهذه المشكلة داخل مدينة الرياض بالمملكة العربية السعودية. هذه المشكلة هي إصابات الفم والأغشية المخاطية بفطر ممرض وهو الكانديدا البيكانز Candida albicans. وطبقا لخطة العمل البحثي تم جمع 50 عزلة من هذا الفطر من منطقة وسط الرياض بمستشفى الملك فيصل التخصصي وهو مستشفى كبير يستوعب حالات مرضية كثيرة وأنواع شتى من الأمراض ولذلك تم جمع العينات منه حتى تكون النتائج حقيقية وصادقة ومعبرة ومحاكية للواقع بقدر الممكن. إن العزلات التي تم جمعها من هذا المستشفى كان قد تم تعريفها من قبل الفريق البحثي بالمستشفى، وبالرغم من هذا تم إعادة زرعها على بيئة السباروود جلوكوز آجار Sabouraud glucose agar للتأكد أولا من نقاءها وثانيا لعمل بعض اختبارات النشاط الانزيمى الدال على وجود فطر الكانديدا البيكانز Candida albicansحيث تتميز أغلب سلالات هذا الفطر بإفراز بعض الإنزيمات مثل الإنزيم المحلل للبروتين proteinase، الإنزيم المحلل للدهون المفسفرة phospholipase، الإنزيم المحلل لبروتين الكولاجين collagenase، الإنزيم المحلل لحامض الهيالورونيك hyaluronidase، الإنزيم المحلل لكبريتات الكوندروتين  chondroitin sulphatase.



            علاوة على ذلك فان الخمائر تمثل جزء من الكائنات الدقيقة التكافلية التي تعيش في التجويف الفمى ووجودها ليس بالضرورة نتيجة مرض إلا إذا وجدت بعض العوامل التي تحولها إلى كائنات ممرضة مثال قلة تدفق اللعاب (Narhi, et al. 1993)، فقر الصحة الفمية (Blair, et al. 1995)، طقم الأسنان الصناعي الغير نظيف (Beighton, et al. 1990)، مرض السكر (Lamey, et al. 1988)، الأورام الخبيثة (Jobbins, et al. 1992; Childers, et al. 1993)، العلاج ذو التأثير السام على الخلايا (Samaranayake, 1984)، وفيروس نقص المناعة المكتسبة في الإنسان (Samaranayake, 1992). إن فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans يعتبر أشهر الفطريات المعزولة من التجويف الفمى للإنسان السليم والمريض على السواء ولكن خاصة في البالغين (Heimdahi and Nord, 1990).



            هناك 25 عزلة من فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans لها القدرة على إفراز الخمس انزيمات السابق ذكرها، 15 عزلة لها القدرة على إفراز الإنزيم المحلل للبروتين proteinase، الإنزيم المحلل للدهون المفسفرة phospholipase، والإنزيم المحلل لبروتين الكولاجين collagenase ولكن غير قادرين على إفراز الإنزيم المحلل لحامض الهيالورونيك hyaluronidase و الإنزيم المحلل لكبريتات الكوندروتين  chondroitin sulphatase و 10 عزلات لها القدرة على إفراز الإنزيم المحلل للبروتين proteinase فقط. وفى دراسة أخرى نشرت أن حامض الهيالورونيك Hyaluronic acid و كبريتات الكوندروتين chondroitin sulphate هي المكونات الأساسية للنسيج الضام والنسيج الطلائى للثة (Lederman, et al. 1972). الإنزيم المحلل لحامض الهيالورونيك hyaluronidase و الإنزيم المحلل لكبريتات الكوندروتين  chondroitin sulphataseو الإنزيم المحلل للبروتين proteinase يؤثروا على نفاذية الأغشية الطلائية عند الفراغات البين خلوية وذلك بمهاجمة المواد الرابطة (الإسمنتية) البين خلوية في النسيج، ونتيجة لهذا التحطيم في الأنسجة يحدث غزو ميكروبي للنسيج (Takeuchi, et al. 1982). أغلب عزلات فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans كانت قادرة على إنتاج الإنزيم المحلل لحامض الهيالورونيك hyaluronidase و الإنزيم المحلل لكبريتات الكوندروتين  chondroitin sulphataseو الإنزيم المحلل للبروتين proteinase والتي تلعب دورا مهما في إحداث أمراض فطر الكانديدا Candidosis (Banno, et al. 1985).



            وعلى الجانب الآخر في هذا البحث تم عزل 120 عزلة أكتينوميسيتية من أنواع ومناطق مختلفة من التربة الزراعية بمدينة الرياض، حيث تم اختبار قدرتهم على تثبيط نمو عزلات فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans. ومن الجدير بالذكر أنه قد وقع الاختيار على مجموعة الأكتينوميسيتات في مقاومة هذا الفطر نظرا لقدرتها الفسيولوجية الفائقة والمعروفة بإنتاج المواد الأيضية الثانوية وخصوصا المواد المضادة للنشاط الميكروبي وبالخصوص جنس الأستربتوميسس حيث ثبت أنه أنتج 90 % من المضادات الحيوية الموجودة في العالم. كان هناك 100 عزلة أكتينوميسيتية ذات نشاط مثبط لفطر الكانديدا البيكانز Candida albicansولكن بشكل متفاوت؛ حيث ثبت أن 40 عزلة أكتينوميسيتية ثبطت نمو الـ 25 عزلة لفطر الكانديدا البيكانز Candida albicans المفرزة للخمس انزيمات الذين ذكروا آنفا ولكن لم يكن لهم تأثير على باقي عزلات الفطر أقواهم عزلة رقم A-10، 35 عزلة أكتينوميسيتية استطاعت أن تثبط الـ 15 عزلة لفطر الكانديدا البيكانز Candida albicans المفرزة للإنزيم المحلل للبروتين proteinase، الإنزيم المحلل للدهون المفسفرة phospholipase، والإنزيم المحلل لبروتين الكولاجين collagenase أقواهم عزلة رقم A-25، 25 عزلة أكتينوميسيتية استطاعت أن تثبط الـ 10 عزلات لفطر الكانديدا البيكانز Candida albicans  المفرزة  للإنزيم المحلل للبروتين proteinase أقواهم عزلة رقم A-72. وقد تم تعريف الثلاث عزلات فثبت أنهم جميعا يتبعوا جنس الأستربتوميسس، فكانت العزلة A-10 استربتوميسس-1، العزلة A-25 استربتوميسس-2، العزلة A-72 استربتوميسس-3.



            وقد ذكر في دراسة أخرى، أنه قد تم اختبار 50 عزلة أكتينوميسيتية لتثبيط نمو فطر الكانديدا البيكانز Candida albicans، وكان من بينهم سلالة واحدة قادرة على تثبيط نمو الفطر وهى استربتوميسس أوليفاشيس Streptomyces olivaceus (khalesi, et al. 2006).





















المراجع العلمية References              

Augustine SK, Bhavsar SP, Kapadnis BP (2005): A non-polyene antifungal antibiotic from Streptomyces albidoflavus PU 23. J. Biosci. 30: 201-211.

Anonyymous (2001): WHO Global strategy for containment of antimicrobial resistance.www.who.int/emo-documents/antimicrobial_resistance/doos/EGlobal_Strat.pdf

Banno, Y.; Yamada, T. and Nozawa, Y. (1985): Secreted phospholipases of the dimorphic fungi Candida albicans. J. Med. Vet. Mycol. 23: 47-54.

Barga, P.; Maci, S.; Sasso, M. and Bohn, M. (1995): Experimental evidence for a role of rilopirox, Nystatin and fluconazole on adherence of Candida albicans. Chemotherapy 42 (4): 259-65.

Barga, P.; Sasso, M.; Maci, S. and Bohn, M. (1996): Inhibition of Candida albicans adherence to human buccal cells. Arzneimittelforschung 45 (1): 84-7.

Beighton, D.; Hellyer, P. and Heath, M. (1990): Association between salivary levels of mutants streptococci, lactobacilli, yeast and dental variable in elderly dental patients. Arch. Oral Biol. 35: 173-5.

Blair, Y.; Bagg, J. and Chestnutt, I. (1995): Microbiological assessment of denture hygiene among patients in daycare community places. Community Dent. Oral epidermiol. 23: 100-3.

Cannon, R.; Masson, A. and Monk, B. (1995): Oral clearance, colonization or candidosis. J. Dent. Res. 74: 1152-61.

Childer, N.; Stinnett, E.; Wheeler, P. and Wright, J. (1993): Oral complication in children with cancer. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. 75: 41-7.

Darwazeh, A.; Farlane, T. and Lamey, P. (1997): The in-vitro adhesion of Candida albicans to buccal epithelial cells. J. Oral. Pathol. Med. 26: 233-36.

Douglas, L. (1986): Adhesion of Candida albicans to epithelial surfaces. CRC Critic Rev. Microbiol. 15: 27-43.

El-Tarabily, K.A.; G.E.St.J. Hardy; K. Sivasithamparam; A.M. Hossein and D.I. Kurtboke (1997): The potential for biological control of cavity-spot disease of carrots, caused by Pythium coloratum streptomycete and non-streptomycete actinomycetes. New Phytol. 137: 495-507.

Feigal, D.W.; M.H. Katz; D. Greenspan and J. Westenhouse et al. (1991): The prevalence of oral lesions in HIV infected homosexual and bisexual men, three San Francisco epidemiological cohorts. AIDS. 5: 519-525.

Goff, D.A.; S.L. Koletar; W.J. Buesching; J. Barnishan and R.J. Fass (1995): Isolation of fluconazole-resistant Candida albicans from human immunodeficiency virus-negative patients never treated with azoles. Clin. Infect. Dis. 20: 77-83.

Gohel V, Singh A, Vimal M, Ashwini P, Chhatpar HS (2006): Bioprospecting and antifungal potential of chitinolytic Microorganisms. Afr. J. Biotechnol. 5: 54-72.

Gordon, R.E. and A.C. Horan, (1974): "A piecemeal description of Streptomyces griseus (Krainsky) Waxman and Henrici." J. Waksman, S.A., (1961): "The Actinomyces vol. ΙΙ "Antibiotics of Actinomycetes". The Williams and Wilkins company, USA. Gen. Microbiol. 50: 223.

Gupte M, Kulkarni P, Ganguli BN (2002): Antifungal antibiotics. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58: 46-57.

Hay RJ (2003): Antifungal drugs used for systemic mycoses. Dermatol. Clin. 21: 577-587.

Heimdahl, A. and Nord, C. (1990): Oral yeast infections in immunocompromized and seriously diseased patients. Acta Odontol. Scand. 48: 77-84.

Iznaga Y, Lemus M, González L, Garmendía L, Nadal L, Vallín C (2004): Antifungal activity of Actinomycetes from Cuban soils. Phytother. Res. 18: 494-496.

Jobbins, J.; Parson, K. and Bagg, J. (1992): Oral carriage of yeasts in patients with advanced malignant disease. J. Oral Pathol. Med. 21: 305-8.

Johnson, L.F.; Curl, E.A.; Bond, J.H. and Fribourg (1959): Methods for studying soil microflora-plant disease relationships. Burgess. Minnegpolis.

Khalesi, E.; G.H. Shahidi Bonjar; S. Aghighi; M.J. Mahdavi and A. Ayatollahi Moosavi (2006): Anti yeast activity of Streptomyces olivaceus strain 115 against Candida albicans. J. Appl. Sci. 6 (3): 524-526.

Kieren, A.M.; C.N. Lyons; T. rustad; R.A. Bowden and T.C. White (1998): Rapid, transient fluconazole resistance in Candida albicans is associated with increased MRNA levels of CDR. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2584-2589.

Kieser, T.; M.J. Bibb; M.J. Buttner; K.F. Chater and D.A. Hopwood (2000): Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation: Norwich, pp: 1-18.

Klein, R.S.; C.A. Harris; C.B. Small; B. Moll; M. Lesser and G.H. Friedland (1984): Oral candidiasis in high-risk patients as the initial manifestation of the acquired immunodeficiency syndrome. New Engl. J. Med. 311: 354-358.

Kuster, E., (1959a): "Introductory remarks to round table conference on streptomycetes stockholm, 1959." Int. Bull. Bact, Nomencl.

Kuster, E., (1959b): "Outline of a comparative study of criteria used in characterization of the actinomycetes." Int. Bull. Bact., Nomencl and taxon. 9: 98-104.

Lamey, P.; Darwaza, A. and Fisher, B. (1988): Secretor status, candidal carriage and candidal infection in patients with diabetes. J. Oral pathol. 17: 354-7.

Lederman, H.; Hayashi, J. and bahn, A. (1972): Chondroitin sulphatase in oral bacterial. J. Dental Res. 51: 206.

Maenza, J.R.; W.G. Merz; M.J. Romagnoli; J.C. Keruly; R.D. Moore and J.E. Gallant (1997): Infection due to fluconazole-resistant Candida in patients with AIDS. Prevalence and microbiology. Microbiol. Clin. Infect. Dis., 24: 28-34.

Michael, E.K. and D. Pharm (2001): Antifungal resistance among Candida species. Pharmacotherapy. 21: 124-132.

Narhi, T.; Ainamo, A. and Meurman, J. (1993): Salivary yeasts, saliva and oral mucosa in the elderly. J. Dental Res. 72: 1009-14.

Nolte, F.S.; T. Parkinson and D.J. Falconer (1997): Isolation and characterization of fluconazole and amphotericin B-resistant Candida albicans from blood of two patients with leukemia. Antimicrob. Agents Chemother. 41: 196-199.

Peterson, D. (1992): Oral Candidosis. Clin. Geriatr. Med. 8: 513-27.

Price, M.; Wilkenson, I. and Gentry, I. (1982): Plate method for detection of phospholipase activity in Candida albicans. Sabouraudi. 20: 7-14.

Pridham, T.G. and Gottlieb, D., (1948): "The utilization of carbon compounds by some actinomycetes as an aid for species determination." J. Bact. 56: 107-114.

Pridham, T.G., Andrson, P.; Foley, C.; Lindenfelser, L.A. Hesseltine, C.W. and Bene diet, R.G., (1957): "A Selection of media for maintenance and taxonomic study of Streptomyces." Antibiot. Annu. 1956-1957, P. 947-953.

Pridham, T.G. and Lyons, J.R., (1961): "Streptomyces albus (Rossi-Doria) Waksman and Henric Taxonomic study of strains labeled Streptomyces albus." J. Bact. 81: 431-441.

Samaranayake, L.; Calman, K. and Ferguson, M. (1984): The oral carriage of yeasts in patients on cytotoxic therapy. J. Oral Pathol. 390-3.

Samaranayake, L. (1992): Oral mycoses in HIV infection. Oral Surg., Oral Med., Oral Pathol. 73: 171-80.  

Shafii Bafti, S.; G.H. Shahidi Bonjar; S. Aghighi; S. Biglari; P. Rashid Farrokhi and A. Aghelizadeh (2005): Biological control of Fusarium oxysporum f. sp. melonis, the causal agent of root rot disease of green house cucurbits in Kerman Province of Iran. Am. J. Biotechnol. Biochem. 1: 22-26.

Shahrokhi, S.; G.H. Shahidi Bonjar and I. Saadoun (2005): Biological control of potato isolate of Rhizoctonia solani by Streptomyces olivaceus strain 115. Biotechnology, 4: 132-138.

Shirling, E.B. and Gottlieb, D. (1966): "Methods for characterization of Streptomyces species." Int. J. Syst. Bact. 16: 313-340.

Takeuchi, H.; Hari, Y.; Kanchisa, J. and Tani, A. (1982): Bacterial hyaluronidase and chondroitin sulphatase in human dental plaque and inflammed gingiva. J. Osaka Dental Univ. 16: 183-7.

Wu, T.; Samaranayake, L.; Cao, B. and Wang, J. (1996): In-vitro proteins production by oral Candida albicans from individual with and without HIV. J. Med. Microbiol. 44 (4): 311-6.


















ليست هناك تعليقات: