من انا

صورتي
الرياض, Saudi Arabia
مسلم، وأناأحوج ما أكون إلى معرفة نفسي

الثلاثاء، 31 يناير، 2012

علم الوراثة Genetics


علم الوراثة  Genetics

تعريف :

هو علم الجينات والوراثة، والتباين في حياة الكائنات الحية .

يتناول علم الوراثة :

 1- التركيب الجزيئي ووظيفة الجينات .      2- سلوك الجينات مع قرينة خلية  أو كائن حي .     3-  نماذج ( أنماط ) الوراثة من الآباء إلى الأبناء (الذرية) .        4- توزيع الجينات.             5- التباين والتغير في السكان .

بالنظر إلى الجينات :

فهي شاملة لحياة الكائنات الحية ، يمكن تطبيق علم الوراثة لدراسة جميع الأنظمة (الأجسام) الحية : 1- من الفيروسات والبكتيريا  ، 2- من خلال النباتات (وخصوصا المحاصيل) . 3- والحيوانات الداجنة  للبشر (كما في علم الوراثة الطبية).

 وقد عُرف  حقيقة الكائنات الحية  : أنها ترث الصفات  inherit Traits عن آبائهم منذ العصور القديمة ( ما قبل التاريخ) لتحسين نباتات المحاصيل والحيوانات من خلال تربية انتقائية.

ومع ذلك ، فإن العلم الحديث في علم الوراثة  يحاول  فهم عملية الوراثة  ، بدأ ذلك الاهتمام  فقط مع أعمال جورجور مندل في منتصف القرن 19. على الرغم من انه لم يكن يعرف المبدأ الطبيعي  للوراثة، حيث لاحظ مندل أن الكائنات الحية ترث الصفات عبر وحدات منفصلة من الميراث، والتي تسمى الآن الجينات .

تسلسل النيوكليوتيدات في الجينات تترجم بواسطة الخلايا لتنتج  سلسلة من الأحماض الأمينية ، والبروتينات المخلّقة -  فترتيب الأحماض الأمينية في بروتين يناظر ترتيب النيوكليوتيدات في الجينات.فالعلاقة بين تسلسل النوكليوتيدات وتسلسل الحمض الأميني تعرف  كشفرة وراثية.

الجينات تتماثل إلى مناطق في داخل الجمض النووي دنا، , والجزيء يتكون  من تسلسل أربعة أنواع مختلفة من النيوكليوتيدات، وتسلسل هذه النيوكليوتيدات تكون هي المعلومات الوراثية التي ترثها الكائنات الحية.

الحمض النووي يوجد بشكل طبيعي في شكل خيوط مزدوجة ، و النيوكليوتيدات على كل خيط  مكملة لبعضها البعض.

يمكن لكل خيط يعمل بمثابة قالب لإنشاء خيط آخر زوج له. هذه هي الطريقة الطبيعية لصنع نسخ من الجينات التي يمكن أن تكون موروثة.

الأحماض الأمينية في البروتين هي التي تحدد كيفية الشكل ثلاثي الأبعاد له، وهذا التركيب هو، بدوره ، مسئول عن وظيفة البروتين.

 البروتينات تنفذ تقريباَ  جميع الوظائف اللازمة للخلايا لكي تحيا (تعيش) .

 التغير في الحمض النووي (دنا) للجين يستطيع  تغيير الحمض النووي للبروتين والتغير يكون في الشكل والوظيفية :  وهذا يمكن أن يكون له تأثير مثير (كبير) في الخلية وعلى الكائن الحي ككل .

على الرغم من أن الجينات الوراثية تلعب دورا كبيرا في مظهر وسلوك الكائنات الحية ، فالسلوك والمظهر هو مزيج من علم الوراثة مع ما اكتسبته الكائنات من تجربة وخبرات الذي يحدد الحصيلة النهائية له. على سبيل المثال : فالبرغم من أن الجينات تلعب دور كبير في تحديد ( حجم -  وغذاء - وصحة ) الكائن  فتجربة الكائن بعد استهلالها لها كذلك تأثير كبير .

ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ

Deoxyribonucleic acid (DNA) 

( دنا ) : هو الحمض النووي الذي يحتوي على التعليمات الجينية المستخدمة في تطوير أداء جميع الكائنات الحية المعروفة ( ماعدا فيروسات RNA).) .

تسمى قطع الحمض النووي التي تحمل هذه المعلومات الوراثية  جينات، ولكن التسلسلات الأخرى للحمض النووي لها أهداف تركيبية ، أو تشارك في التنظيم باستخدام هذه المعلومات الوراثية.

 بجانب ( رنا ) والبروتينات فإن الـ ( دنا ) هي واحدة من الثلاث الجزيئات الرئيسية (الكبيرة) التي تكون أساسية (جوهرية) لكل أشكال الحياة المعروفة .

الحمض النووي يتكون من اثنين من إنزيمات البوليمرات طويلة من وحدات بسيطة تسمى النيوكليوتيدات، وعمودها الفقرى مصنوعة من السكر والمجموعات الفوسفورية المرتبطة بواسطة روابط أسترية. هذه  خيطين مسارها في اتجاهين متعاكسين لبعضهما البعض، وبالتالي غير متوازي .

الارتباط على أي سكر يكون واحد من أربعة أنواع  من الجزيئات تسمى نيوكليوبيس  , هذه  تكون سلسلة من أربع نيوكليوبيس بالإضافة للعمود الفقري (المذكور أعلاه) التي تمثل المعلومات الترميزية ,  هذه المعلومات تقرأ باستخدام الشفرة الوراثية التي تحدد تسلسل الأحماض الأمينية داخل البروتينات , قراءة الشفرة عن طريق نسخ من الحمض النووي  دنا منتشرة ( ممتدة) داخل الحمض النووي المتعلقة بـ ( رنا ) في عملية تسمى الترجمة .

الشفرة الوراثية

الشفرة الوراثية : هي مجموعة من القواعد التي يتم من خلالها ترجمة المعلومات المشفرة في المادة الوراثية ( تسلسل دنا او رنا ) داخل البروتينات ( سلسلة الحمض الأميني ) عن طريق خلايا حية .

الكود الذي يحدد كيفية تسلسل  (3) نيوكليوتيدات تسمى ( كودون ) , وتحديداَ الحمض الأميني الذي سيتم إضافته خلال تخليق البروتين القادم , فمع بعض الاستثناءات فالـ (3) نيوكليوتيدات  كودون في تسلسل الأحماض الأمينية تحدد حمض أميني واحد  .

 داخل الخلايا فإن الحمض النووي يكون منظم  داخل تركيب طويل  يسمى ( كروموسوم ) , أثناء انقسام الخلايا فإن هذه الكروموسومات تكون مكررة في عملية تضاعف الحمض النووي دنا , فكل خلية توفر لنفسها مجموعة كاملة من الكروموسومات .

الكائنات حقيقة النواة مثل ( الحيوانات والنباتات والفطريات والبروتوزوا) تخزن معظم الحمض النووي داخل نواة الخلية  وبعضها في  العضيات مثل الميتوكنريا والبلاستيدات الخضراء .

وبالمقابل الكائنات بدائية النواة ( البكتيريا والأرشيا ) تخزن حمضها النووي فقط داخل السيتوبلازم   ,  تتضمن الكروموسومات بروتينات ملونة مثل  /هيستونس  مدمج  وحمض نووي دنا منشأ  , هذه التراكيب المدمجة (متضامة) تقود التفاعل بين الحمض النووي دنا والبروتينات الأخرى ( الإنزيمات) وتساعد على ضبط أي من أجزاء الأحماض النوويه دنا التي تم نسخها .



تركيب الحمض النووي :

- الحمض النووي دنا عبارة عن بوليمر طويل يتكون من وحدات متكررة تسمى نيوكليوتيدات .  ,  أول من أكتشفه بواسطة جمس واتسن وفرانسيس كريك  , وتركيب الحمض النووي دنا لكل الأنواع يتضمن اثنتان من السلاسل الحلزونية  تلتف كل جولة في نفس المحور .

- العمود الفقري (أو المكونات الرئيسية) لخيط الحمض النووي يتكون من تعاقب بقايا المجموعة الفوسفاتية والسكر  , فالسكر في الحمض النووي دنا يكون 2- ديوكسيرايبوز وهو سكر بنتوز ( خمس كربونات) .

- فالسكريات ترتبط مع بعضها عن طريق مجموعة الفوسفات  التي تكون على شكل روابط فوسفاتية ثنائية الأستر  بين ذرتي الكربون الثالثة و الخامسة من حلقات السكر المجاورة .

- هذه الروابط تكون غير متماثلة مما يعني أن الخيط من الحمض النووي دنا لديها توجيه.

- في الحلزون المزدوج يكون اتجاه النيوكليوتيدات في إحدى الخيوط هو عكس اتجاهه في الخيط الآخر : فالخيوط تكون في توازي عكسي ..(عكسي التوازي).

- النهايات الغير متماثلة من خيوط الحمض النووي دنا تسمى النهاية الطرفية الخامسة والنهاية الطرفية الثالثة  , فالنهاية الطرفية الخامسة تمتلك في نهاية طرفها مجموعة الفوسفات والنهاية الطرفية الثالثة تملك في طرفها النهائي مجموعة الهيدروكسيل .

- واحدة من الاختلافات الرئيسية بين الـ دنا والـ رنا يكون في السكر ففي الحمض النووي دنا يكون السكر 2- دايوكسي رايبوز  , بينما في الـ (رنا) يكون يستعاض عنه بديل الريبوز البنتوز.



انتهت الترجمة / مع تحيات المترجم (عبدالعزيز يحي الغامدي - طالب الدكتوراه في قسم الأحياء الدقيقة بجامعة الملك سعود).























علم الوراثة  Genetics

Genetics : is the science of genes, heredity, and variation in living organism.

هو علم الجينات والوراثة، والتباين في حياة الكائنات الحية .

Genetics deals:

1- with the molecular structure and function of genes.

2- with gene behavior in the context of a cell or organism.

3- with patterns of inheritance from parent to offspring.

4- and with gene distribution.

5- variation and change in populations.

يتناول علم الوراثة : 1- التركيب الجزيئي ووظيفة الجينات .2- سلوك الجينات مع قرينة خلية  أو كائن حي .      3-  نماذج ( أنماط ) الوراثة (إرث) من الآباء إلى الأبناء (الذرية) . 4- توزيع الجينات.       5- التباين والتغير في السكان .

      Given that genes are universal to living organisms, genetics can be applied to the study of all living systems,   from  :

1- viruses and bacteria,      2-  through plants (especially crops).     3- and domestic animals to humans (as in medical genetics).

بالنظر إلى الجينات فهي شاملة لحياة الكائنات الحية ، يمكن تطبيق علم الوراثة لدراسة جميع الأنظمة (الأجسام) الحية : 1- من الفيروسات والبكتيريا  ، 2- من خلال النباتات (وخصوصا المحاصيل) . 3- والحيوانات الداجنة  للبشر (كما في علم الوراثة الطبية).

The fact that living things inherit  traits from their parents has been used since prehistoric times to improve crop plants and animals through selective breeding.

    وقد عُرف (أو استخدم) حقيقة أن الكائنات الحية ترثinherit  الصفات  Traits عن آبائهم منذ عصور ما قبل التاريخ لتحسين نباتات المحاصيل والحيوانات من خلال تربية انتقائية.

                       However, the modern science of genetics, which seeks to understand the process of inheritance, only began with the work of Gregor Mendel in the mid-19th century.

Although he did not know the physical basis for heredity, Mendel observed that organisms inherit traits via discrete units of inheritance, which are now called genes.

          ومع ذلك ، فإن العلم الحديث في علم الوراثة ، الذي يبحث أو يحاول  يفهم عملية الميراث ، وبدأت فقط مع أعمال جريجور مندل في منتصف القرن 19. على الرغم من انه لم يكن يعرف المبدأ الطبيعي  للوراثة، لاحظ مندل أن الكائنات الحية ترث الصفات عبر وحدات منفصلة من الميراث، والتي تسمى الآن الجينات.



                      The sequence of nucleotides in a gene is translated by cells to produce a chain of amino acids , creating proteins—the order of amino acids in a protein corresponds to the order of nucleotides in the gene.

                       This relationship between nucleotide sequence and amino acid sequence is known as the genetic code.

تسلسل النيوكليوتيدات في الجينات تترجم بواسطة الخلايا لتنتج  سلسلة من الأحماض الأمينية ، والبروتينات المخلّقة -  فترتيب الأحماض الأمينية في بروتين يناظر ترتيب النيوكليوتيدات في الجينات.
ومن المعروف أن هذه العلاقة بين تسلسل النوكليوتيدات وتسلسل الحمض الأميني تعرف  كشفرة الوراثية.

- Genes correspond to regions within DNA, a molecule composed of a chain of four different types of nucleotides—the sequence of these nucleotides is the genetic information organisms inherit.

 الجينات تتماثل إلى مناطق في داخل الجمض النووي دنا، , والجزيء يتكون  من تسلسل أربعة أنواع مختلفة من النيوكليوتيدات، وتسلسل هذه النيوكليوتيدات تكون هي المعلومات الوراثية التي ترثها الكائنات الحية.

                     - DNA naturally occurs in a double stranded form, with nucleotides on each strand complementary to each other.

       الحمض النووي يـظهر  بشكل طبيعي في شكل خيوط مزدوجة ، و النيوكليوتيدات على كل خيط  مكملة لبعضها البعض .

                     - Each strand can act as a template for creating a new partner strand. This is the physical method for making copies of genes that can be inherited.

  يمكن لكل خيط يعمل بمثابة قالب لإنشاء خيط آخر زوج له. هذا هو الأسلوب الطبيعي لصنع نسخ من الجينات التي يمكن أن تكون موروثة.

The amino acids in a protein determine how it folds into a three-dimensional shape; this structure is, in turn, responsible for the protein's function.

الأحماض الأمينية في البروتين هي التي تحدد كيفية الشكل ثلاثي الأبعاد له، وهذا التركيب هو، بدوره ، مسئول عن وظيفة البروتين.

          Proteins carry out almost all the functions needed for cells to live.

البروتينات تنفذ تقريباَ  جميع الوظائف اللازمة للخلايا لكي تحيا (تعيش) .

                     A change to the DNA in a gene can change a protein's amino acids, changing its shape and function: this can have a dramatic effect in the cell and on the organism as a whole.

التغير في الحمض النووي (دنا) للجين يستطيع  تغيير الحمض النووي للبروتين والتغير يكون في الشكل والوظيفية :  وهذا يمكن أن يكون له تأثير مثير (كبير) في الخلية وعلى الكائن الحي ككل .

Although genetics plays a large role in the appearance and behavior of organisms, it is the combination of genetics with what an organism experiences that determines the ultimate outcome.

على الرغم من أن الجينات الوراثية تلعب دورا كبيرا في مظهر وسلوك الكائنات الحية ، فالسلوك والمظهر هو مزيج من علم الوراثة مع ما اكتسبته الكائنات من تجربة وخبرات الذي يحدد الحصيلة النهائية له.

      For example : while genes play a role in determining an organism's size, the nutrition and health it experiences after inception also have a large effect.

على سبيل المثال : فالبرغم من أن الجينات تلعب دور كبير في تحديد ( حجم -  وغذاء - وصحة ) الكائن  فتجربة الكائن بعد استهلالها لها كذلك تأثير كبير .

ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ

Deoxyribonucleic acid (DNA) 

 DNA is a nucleic acid that contains the genetic instructions used in the development and functioning of all known living organisms (with the exception of RNA viruses).

( دنا ) : هو الحمض النووي الذي يحتوي على التعليمات الجينية المستخدمة في تطوير الأداء وجميع الكائنات الحية المعروفة ( ماعدا فيروسات RNA).) .

 The DNA segments that carry this genetic information are called genes, but other DNA sequences have structural purposes, or are involved in regulating the use of this genetic information.

تسمى قطع الحمض النووي التي تحمل هذه المعلومات الوراثية  جينات، ولكن التسلسلات الأخرى للحمض النووي بهدف التركيب ، أو تشارك في التنظيم باستخدام هذه المعلومات الوراثية.

 Along  with RNA and proteins, DNA is one of the three major macromolecules that are essential for all known forms of life.

بجانب ( رنا ) والبروتينات فإن الـ ( دنا ) هي واحدة من الثلاث الجزيئات الرئيسية (الكبيرة) التي تكون أساسية (جوهرية) لكل أشكال الحياة المعروفة

DNA consists of two long polymers of simple units called nucleotides, with backbones  made of sugars and phosphate groups joined by ester bonds.

الحمض النووي يتكون من اثنين من إنزيمات البوليمرات طويلة من وحدات بسيطة تسمى النيوكليوتيدات، وعمودها الفقرى مصنوعة من السكر والمجموعات الفوسفورية المرتبطة بواسطة روابط أسترية.

These two strands run in opposite directions to each other and are therefore anti -parallel.

هذه  خيطين مسارها في اتجاهين متعاكسين لبعضهما البعض، وبالتالي غير متوازي .

Attached to each sugar is one of four types of molecules called nucleobases (informally, bases).

الارتباط على أي سكر يكون واحد من أربعة أنواع  من الجزيئات تسمى نيوكليوبيس .

It is the sequence of these four nucleobases along the backbone that encodes information.

هذه  تكون سلسلة من أربع نيوكليوبيس بالإضافة للعمود الفقري (المذكور أعلاه) التي تمثل المعلومات الترميزية .

   This information is read using the genetic code, which specifies the sequence of the amino acids within proteins.

هذه المعلومات تقرأ باستخدام الشفرة الوراثية التي تحدد تسلسل الأحماض الأمينية داخل البروتينات .

    The code is read by copying stretches of DNA into the related nucleic acid RNA in a process called transcription.

قراءة الشفرة عن طريق نسخ من الحمض النووي  دنا منتشرة ( ممتدة) داخل الحمض النووي المتعلقة بـ ( رنا ) في عملية تسمى الترجمة .

ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ

Genetic Code

              The genetic code is the set of rules by which information encoded in genetic material (DNA or mRNA sequences) is translated into proteins (amino acid sequences) by living cells.

The code defines how sequences of three nucleotides, called codons, specify which amino acid will be added next during protein synthesis. With some exceptions, a three-nucleotide codon in a nucleic acid sequence specifies a single amino acid.


الشفرة الوراثية : هي مجموعة من القواعد التي يتم من خلالها ترجمة المعلومات المشفرة في المادة الوراثية ( تسلسل دنا او رنا ) داخل البروتينات ( تسلسلات الحمض الأميني ) عن طريق خلايا حية .

الكود الذي يحدد كيفية تسلسل  (3) نيوكليوتيدات تسمى ( كودون ) , وتحديداَ الحمض الأميني الذي سيتم إضافته خلال تخليق البروتين القادم , فمع بعض الاستثناءات فالـ (3) نيوكليوتيدات  كودون في تسلسل الأحماض الأمينية تحدد حمض أميني واحد  .

              Within cells DNA is organized into long structures called chromosomes.

 داخل الخلايا فإن الحمض النووي يكون منظم  داخل تركيب طويل  يسمى ( كروموسوم ) .

              During cell division these chromosomes are duplicated in the process of DNA replication, providing each cell its own complete set of chromosomes.



أثناء انقسام الخلايا فإن هذه الكروموسومات تكون مكررة في عملية تضاعف الحمض النووي دنا , فكل خلية توفر لنفسها مجموعة كاملة من الكروموسومات



              Eukaryotic organisms (animals, plants, fungi, and protists) store most of their DNA inside the cell nucleus and some of their DNA in organelles, such as mitochondria or chloroplasts.

الكائنات حقيقة النواة مثل ( الحيوانات والنباتات والفطريات والبروتوزوا) تخزن معظم الحمض النووي داخل نواة الخلية  وبعضها في  العضيات مثل الميتوكنريا والبلاستيدات الخضراء .

              In contrast, prokaryotes (bacteria and archaea) store their DNA only in the cytoplasm.

              Within the chromosomes, chromatin proteins such as histones compact and organize DNA.

              These compact structures guide the interactions between DNA and other proteins (enzymes), helping control which parts of the DNA are transcribed.

وبالمقابل الكائنات بدائية النواة ( البكتيريا والأرشيا ) تخزن حمضها النووي فقط داخل السيتوبلازم   ,  تتضمن الكروموسومات بروتينات ملونة مثل  /هيستونس  مدمج  وحمض نووي دنا منشأ  , هذه التراكيب المدمجة (متضامة) تقود التفاعل بين الحمض النووي دنا والبروتينات الأخرى ( الإنزيمات) وتساعد على ضبط أي من أجزاء الأحماض النوويه دنا التي تم نسخها .

ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ

Structure of DNA

           DNA is a long polymer made from repeating units called nucleotides.

           As first discovered by James D. Watson and Francis Crick, the structure of DNA of all species comprises two helical chains each coiled round the same axis.



- الحمض النوويدنا عبارة عن بوليمر طويل يتكون من وحدات متكررة تسمى نيوكليوتيدات .  ,  أول من أكتشف بواسطة جمس واتسن وفرانسيس كريك  , وتركيب الحمض النووي دنا لكل الأنواع يتضمن اثنتان من السلاسل الحلزونية  تلتف كل جولة في نفس المحور .


              The backbone of the DNA strand is made from alternating phosphate and sugar residues.

               The sugar in DNA is 2-deoxyribose, which is a pentose (five-carbon) sugar.



              The sugars are joined together by phosphate groups that form phosphodiester bonds between the third and fifth carbon atoms of adjacent sugar rings.



العمود الفقري (أو المكونات الرئيسية) لخيط الحمض النووي يتكون من تعاقب بقايا المجموعة الفوسفاتية والسكر  , فالسكر في الحمض النووي دنا يكون 2- ديوكسيرايبوز وهي سكر بنتوز ( خمس كربونات) .

فالسكريات ترتبط مع بعضها بواسطة مجموعة الفوسفات  التي تكون على شكل روابط فوسفاتية ثنائية الأستر  بين ذرتي الكربون الثالثة والخامسة من حلقات السكر المجاورة .

              These asymmetric bonds mean a strand of DNA has a direction.



              In a double helix the direction of the nucleotides in one strand is opposite to their direction in the other strand: the strands are antiparallel.



هذه الروابط الغير متماثلة تعني أن الخيط من الحمض النووي دنا لديها توجيه معين , - , في الحلزون المزدوج يكون اتجاه النيوكليوتيدات في إحدى الخيوط هو عكس اتجاهه في الخيط الآخر : فالخيوط تكون في توازي عكسي ..(عكسي التوازي).

              The asymmetric ends of DNA strands are called the 5′ (five prime) and 3′ (three prime) ends, with the 5' end having a terminal phosphate group and the 3' end having a terminal hydroxyl group.

One major difference between DNA and RNA is the sugar, with the 2-deoxyribose in DNA being replaced by the alternative pentose sugar ribose in RNA



النهايات الغير متماثلة من خيوط الحمض النووي دنا تسمى النهاية الطرفية الخامسة والنهاية الطرفية الثالثة  , فالنهاية الطرفية الخامسة تمتلك في نهاية طرفها مجموعة الفوسفات والنهاية الطرفية الثالثة تملك في طرفها النهائي مجموعة الهيدروكسيل .

واحدة من الاختلافات الرئيسية بين الـ دنا والـ رنا يكون في السكر ففي الحمض النووي دنا يكون السكر 2- دايوكسي رايبوز  , بينما في الـ (رنا) يكون يستعاض عنه بديل الريبوز البنتوز.

































Lecture (2)

PCR

     The polymerase chain reaction (PCR) is a scientific technique in molecular biology to amplify a single or a few copies of a piece of DNA across several orders of magnitude, generatingتوليد  thousands to millions of copies of a particular DNA sequence.

       تفاعل البلمرة هو تقنية علمية في علم البيئة الجزيئي لتضاعف واحد أو قليل من النسخ من الحمض النووي دنا عبر العديد من الأوامر الهامة أو (الكبيرة) , لتوليد الآلف إلى الملايين من النسخ لسلسلة الحمض النووي دنا  بصفة خاصة .

                      

                      Developed in 1983 by Kary Mullis, PCR is now  a common and often   indispensable technique used in medical and biological research labs for a variety of applications.

طورت هذه التقنية عام 1983م من قبل العالم كيري موليس , وهي تقنية شائعة و أساسية تستخدم في مختبرات الأبحاث الطبية والبيولوجية للعديد من التطبيقات المتنوعة .

              Applications include :

              DNA cloning  for sequencing , DNA-based phylogeny, or functional analysis of genes; the diagnosisتشخيص  of hereditary diseases; the identificationتطابق تماثل of genetic fingerprints (used in forensic sciences and parental testing); and the detection and diagnosis of infectious diseases تشخيص و كشف الأمراض المعدية.



 التطبقات تتضمن :

 1- استنساخ الحمض النووي للتسلسل . 2- تحليل أداء الجينات . 3- تشخيص الأمراض الوراثية . 4- تماثل البصمة الوراثية .( في العلم الشرعي واختبار الأبوة ) 5- كشف وتشخيص الأمراض المعدية .

              In 1993, Mullis was awarded منح the Nobel Prize in Chemistry along with Michael Smith for his work on PCR.



              The method relies  on thermal cycling , consisting  of cycles of repeated heating and cooling of the reaction for DNA denaturationمسخ and enzymatic replication of the DNA.

              هذه الطريقة تعتمد على الدورة الحرارية , المؤلفة من دورات تسخين وتبريد مكررة لتفاعلات مسخ الحمض النووي  والتضاعف الإنزيمي  للحمض النووي دنا .

               

              Primers (short DNA fragments) containing sequences complementary to the target region along  with a DNA polymerase (after which the method is named) are key components to enableيمكن selective and repeated amplification.



البريمرز (قطع صغيرة من الحمض النووي دنا) تحتوي على تسلسل كامل للمنطقة المستهدفة وبرفقته إنزيم البوليمير , والمركبات هذه هي المفتاح لتمكين المضاعفات  المكررة والمنتقاة .








      As PCR progressesكما تقدم , the DNA generatedولدت is itself used as a template for replication, setting in motion a chain reaction in which the DNA template is amplified.

      من ايجابية الـ بي سي آر : الحمض النووي الأصل هو في حد ذاته  يستخدم كقالب للنسخ , إعداد الحركة للتفاعل المقيد الذي يضاعف قالب الحمض النووي

      PCR can be extensively  modified to perform   a wide array of genetic manipulationsتلاعب .

يمكن تعديل الـ بي سي آر على نطاق واسع لأداء مجموعة واسعة من التلاعب الجيني .




             Almost all PCR applications employيستعمل  a heat-stable DNA polymerase, such as Taq polymerase, an enzyme originally isolated from the bacterium Thermus aquaticus.

إنزيم البلمرة دنا ذات الحرارة المتوازنة مثل تاق بوليميرز المنزوع ....  تقريباً كل تطبيقات بي سي آر تستخدم



             This DNA polymerase enzymatically assemblesيجمّع أو يركب a new DNA strandخيط  from DNA building-blocks, the nucleotides, by using single-stranded DNA as a template and primers, which are required for initiationبدائي of DNA synthesisتركيب أو.

هذا البوليميرز دنا يعمل التجميع الإنزيمي لخيط دنا الجديد من صفوف بناء الحمض النووي دنا " النيوكليوتيدات" عن طريق استخدام خيط مفرد من الحمض النووي دنا كقالب وبريميرز , وهي مطلوبة  من أجل الشروع في تأليف حمض نووي .



PCR principles and procedure

              PCR is used to عادة  amplify a specific region  يضاعف مناطق محددة of a DNA strand (the DNA target).



              Most PCR methods typicallyنموذج amplify DNA fragments of up to ~10 kilo base pairs (kb), although some techniques allow for amplification of fragments up to 40 kb in size.

التقنيات تسمح بالمضاعفة إلى 40  معظم طرق بي سي آر عادة تضاعف قطع دنا لتصل 10 ك ب , على الرغم من أن بعض

              A basic PCR set up requires several  components and reagents. These components include:;,    فمبدأ الـ بي سي آر يتطلب إعداد العديد من المركبات والكواشف الكيميائية وهذه تتضمن المركبات التالية

1.                DNA template that contains the DNA region (targetهدف) to be amplified.

2.                Two primers that are complementary to the 3' (three prime) ends of each of the DNA target.

3.                Taq polymerase or another DNA polymerase with  a temperature optimum at around 70 °C.

4.                Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs; nucleotides containing triphosphate groups), the building-blocks from which the DNA polymerase synthesizesيركب يؤلف a new DNA strand.

5.                Buffer solution, providingمزود a suitable chemical environment for optimum activity and stabilityثبات of the DNA polymerase.

6.                Divalent cationsكاتيونات ثنائية التكافؤ) ),  (magnesium or manganese ions; generally Mg2+ is used, but Mn2+ can be utilizedمفيدة for PCR-mediatedوسط DNA mutagenesisطفرات, as higher Mn2+ concentrationتركيز increasesيزيد the error rate during DNA synthesis.تأليف أو تجميع

7.                Monovalent cation potassium ions.ايون بوتاسيوم موجب التكافؤ



              The PCR is commonly carried out  in a reaction volume of 10–200 μl in small reaction tubes (0.2– 0.5 ml volumes) in a thermal cycler.

عامةً يتم انجاز التفاعل في حجم (10 -200 ) في أنابيب تفاعل صغيرة في الدورة الحرارية .

              The thermal cycler heats and cools the reaction tubes to achieve the temperatures required at each step of the reaction.

              الدورة الحرارية تبرد وتسخن أنابيب التفاعل لتحقيق درجة الحرارة المطلوبة لكل خطوة من التفاعل

              Many modern thermal cyclers make use of  يستفيد منthe Politer effect, which permits يسمح  both heating and cooling of the block holding the PCR tubes simplyالعمل ببساطة  by reversing the electric currentتيار كهرباي عكسي  



              Thin-walled reaction tubes  permitيجيز favorable thermal conductivity  to allow for rapid  thermal equilibrationموازنة.

الملائمة لتسمح لموازنة حرارية سريعة  أنابيب التفاعل تكون رقيقة جداَ لتسمح للموصلية الحرارية

              Most thermal cyclers have heated lids أغطية to prevent  condensationتكثيف at the top of the reaction tube.

معظم الدورات الحرارية لديها أغطية حرارية لتمنع التكثيف أعلى أنبوب التفاعل . ؟

              Older thermo cyclers lackingافتقرت a heated lidغطاء require a layerطبقة of oil on top of the reaction mixture or a ball of waxكرة من الشمع inside the tube.



Procedure

              Typically, PCR consists of a series of 20-40 repeated temperature changes, called cycles, with each cycle commonly consisting of 2-3 discrete temperature steps, usually three .



 بشكل عام ، PCR يتكون من سلسلة من التغيرات في درجات الحرارة 20-40 المتكررة، تسمى دورات ، مع كل دورة تتكون عادة من 2-3  خطوات لدرجات الحرارة المنفصلة، (وعادة ثلاثة).



              The cycling is often precededسبقت  by a single temperature step (called hold) at a high temperature (>90°C), and followed by one hold at the end for final product extension or brief storage مخزون قصير الأمد.



غالباً تسبق هذه الدورة مرحلة حرارية واحدة تسمى ( هولد ) على درجة حرارة عالية أعلى من (90م) ,  كما يتبع نهاية الخطوة النهائية (التمديد) خطوة  تخزين وجيز . 

              The temperatures used and the length of time they are applied  in each

              Parameters include : the enzyme used for DNA synthesis, the concentrationتركيز of divalent ions and dNTPs in the reaction, and the melting temperature (Tm) of the primers.

درجات الحرارة المستخدمة وطول الفترة الزمنية المطبقة مع كل عامل تغيير  تتضمن :

1- الإنزيم المستخدم لتصنيع الحمض النووي دنا .   2- تركيز الأيونات ثنائية التكافؤ  ونيوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات في التفاعلات . 3- درجة حرارة الاذابة .



1.    Initialization step: This step consists of heating the reaction to a temperature of 94–96 °C (or 98 °C if extremely thermo stableمستقر polymerases are used), which is heldاستمرت for 1–9 minutes. It is only required for DNA polymerases that require heat activation.



1- خطوة التهيئة : هذه الخطوة تتضمن درجة حرارة عالية للتفاعل (94 -96 م) " أو 98م إذا الحرارة مستقرة للغاية للإنزيم المستخدم " والتي تستمر لـ ( 1 - 9) دقائق . هذه الخطوة تتطلب تنشيط للحرارة .



2.    Denaturation step: This step is the first regular cycling eventنتيجة and consists of heating the reaction to 94–98 °C for 20–30 seconds. It causes DNA meltingتبدد أو يفك of the DNA template by disruptingتفكك  the hydrogen bondsروابط between complementaryالمتممة bases, yieldingيتخلّى single-stranded DNA molecules.



2- خطوة التمسخ (التفكك) : هذه الخطوة هي أول حالة الدورات المنتظمة وتتضمن حرارة التفاعل ( 94 -98 م) لمدة 20 -30 ثانية هذه الخطوة  تسبب تفكك للحمض النووي دنا للقالب عن طريق تفكك الروابط الهيدروجينية بين القواعد المتممة فجزيء الحمض النووي دنا يصبح خيط مفرد .

3.    Annealing step   : The reaction temperature is lowered to 50–65 °C for 20–40 seconds allowing annealing of the primers to the single-stranded DNA template. Stable DNA-DNA hydrogen bonds are only formed when the primer sequence very closelyبإحكام matches يتزواج أو تنسجم the template sequenceتسلسل. The polymerase bindsتربط to the primer-template hybrid and beginsتنشيء DNA synthesis .

3- خطوة الالتصاق :  في هذه الخطوة تنخفض درجة الحرارة إلى 50 -65 م لمدة 20 -40 ثانية , وهنا يسمح بالإلتصاق البريمير لخيط مفرد من الحمض النووي القالب , واستقرار الروابط الهيدروجينية بين الحمضين النووين يتشكل فقط عندما تنسجم بإحكام تسلسل البريمير مع تسلسل القالب  . انزيم البليمريربط  هجين البليمر إلى القالب ويبدا في تصنيع حمض نووي جديد .

4.    Extension/elongation step: The temperature at this step depends on the DNA polymerase used; Taq polymerase has its optimum activity temperature at 75–80 °C, and commonly a temperature of 72 °C is used with this enzyme. At this step the DNA polymerase synthesizes a new DNA strandخيط complementary to the DNA template strand by adding dNTPs that are complementary to the template in 5' to 3' direction, condensing  بايجاز the 5'-phosphate group of the dNTPs with the 3'-hydroxyl group at the end of the extending DNA strand. The extension time depends both on the DNA polymerase used and on the length of the DNA fragment to be amplified. As a rule-of-thumb, at its optimum temperature, the DNA polymerase will polymerize a thousand bases per minute.



4-خطوة التمدد : درجة الحرارة في هذه الخطوة تعتمد على انزيم البزليميرز المستخدم ( تاق بوليميرز) والتي تكون درجة الحرارة فيها بالضبط (75 -80 م ) ودرجة الحرارة الشائعة 72 م المستخدمة مع هذا الانزيم  , في هذه الخطوة انزيم البوليميرز للحمض النووي دنا يصنع خيط جديد متمم للخيط القالب  عن طريق إضافة  قطعة من دبل نيوكليوتيدة ثلاثي الفوسفات التي تكون مكملة للقالب في الاتجاه 5 إلى 3 , بايجاز مجموعة الفوسفات في النهاية 5 للـ دبل نيوكليوتيدترايفوسفات مع نهاية 3 لمجموعة الهيدروكسيل علىخيط الحمض النووي الممتد . وقت التمدد أو الاستطالة يعتمد على انزيم البوليميرز المستخدم لكليهما  & وعلى طول قطعة الحمض النووي التي تضاعفت . وكقاعدة عامة : على درجة حرارتها المثلى انزيم البوليميرز سوف يتبلمر على أساس ألف مرة لكل دقيقة

5.    Final elongation: This single step is occasionallyاحياناً performedتَنجز at a temperature of 70–74 °C for 5–15 minutes after the last PCR cycle to ensureيضمن that any remainingبقايا  single-stranded DNA is fully extendedيمتد تماماً .

6.     

7.    Final hold: This step at 4–15 °C for an indefinite غير محدد time may be employed for short-termفترة storageمخزن of the reaction.



Schematic drawing of the PCR cycle. (1) Denaturing at 94–96 °C. (2) Annealing at ~65 °C (3) Elongation at 72 °C. Four cycles are shown here. The blue lines represent the DNA template to which primers (red arrows) anneal that are extended by the DNA polymerase (light green circles), to give shorter DNA products (green lines), which themselves are used as templates as PCR progresses.







ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ

PCR stages

      The PCR process can be dividedمقسمة  into three stagesمراحل :

1.    Exponential amplification: At every cycle, the amount of product is doubled (assumingمفترض  100% reaction efficiencyفعالية ). The reaction is very sensitive: only minute quantities كمية دقيقة  of DNA need to be present.

1- هذه المرحلة لكل دورة , الكمية المنتجة تكون متضاعفة (يفترض فعالية التفاعل تكون 100%) . هذا التفاعل حساس جداً : كميات دقيقة فقط من الحمض النووي تحتاج أن تكون موجودة .

2.    Leveling off stage: The reaction slows as the DNA polymerase loses activity and as consumptionاستهلاك (سل) of reagents such as dNTPs and primers causes them to become limiting.

2- في هذه المرحلة التفاعل بطيء كما ان بوليميرز الحمض النووي يفقد نشاطه .



3.    Plateau: No more product accumulatesيتراكم (يتكدس) due to exhaustionاستنزاف  of reagents and enzyme.

3- في هذه المرحلة  لا تتراكم كثير من المنتجات بسبب استنزاف الكواشف الكيميائية والإنزيمات .



PCR optimization  (PCRالأمثل)

              In practiceالممارسة , PCR can fail يفشل for various متباين متنوع reasons, in part due to its sensitivity to contamination causing amplification of spuriousزائف  DNA products. Because of this, a number of techniques and proceduresإجراءات  have been developed for optimizing PCR conditions.

أثناء الممارسة فإن بي سي آر يفشل لأسباب متنوعة   ويرجع ذلك لحساسيته للتلوث مما يعطي تضخم زائف  , وبسبب ذلك فقد تم تظوير العديد من التقنيات والإجراءات لتحسين الظروف المثلى للـ بي سي آر .

              Contamination with extraneousغريب دخيل  DNA is addressedموجّه with lab protocols and procedures that separateمستقل  pre-PCR mixtures from potentialكامن محتمل  DNA contaminants.

تعالج تلوث الحمض النووي بعمل إجراءا ت في المختبر تتمثل بفصل االخليط ما قبل عمل  بي سي آر  لتفادي ملوثات الحمض النووي المحتمل .

             This usually involves spatial separation of PCR-setup areas from areas for analysis or purification of PCR products, use of disposable plasticware, and thoroughly cleaning the work surface between reaction setups.



وهذه عادة تستلزم فصل مكاني لـمناطق إعداد بي سي آر من مناطق التحليل أو التنقية للـ بي سي آر المنتجة , يستخدم لذلك ................. ومن خلال تنظيف التام  لسطح العمل خلال مراحل التفاعل .

      Primer-design techniques are important in improving PCR product yield and in avoiding the formation of spurious products, and the usage of alternate buffer components or polymerase enzymes can help with amplification of long or otherwise problematic regions of DNA. Addition of reagents, such as formamide, in buffer systems may increase the specificity and yield of PCR.



 تقنية تصميم البريمر يكون مهم  لكي تمنح منتج بي سي آر محسن و لتجنب الأشكال المنتجة الزائفة , المعاملة بمركبات البفر المتعاقبة وانزيمات البوليمر تستطيع المساعدة في تطويل عمليات التضخيم أو مختلف مناطق الاشكالية للحمض النووي  , بالاضافة لذلك الكواشف الكيميائية مثب فورماميد في انظمة البفر ربما يزيد زيادة نوعية وانتاجية للـ بي سي آر .



















LECTURE (3)

Molecular Methods of Microbial Community Analyses

              The three fundamental questions that exist while discovering and characterizing any natural or artificial ecosystem are the following :

              (1) what type of microorganisms are present?

              (2) what do these microorganisms do?

              and (3) how do the activities of these microorganisms relate  to ecosystem functions.

              Many biochemical and molecular methods have been applied to reveal  the microbial community composition over time and space in response to environmental changes .














Partial Community Analysis Approaches

    These strategies  generally  include polymerase chain reaction (PCR)-based methods.



    where total DNA/RNA extracted from an environmental sample is used as a template for the characterization of microorganisms.

     حيث يتم استخدام مجموع الأحماض النووية المستخرجة من عينات بيئية كنموذج لوصف الكائنات الحية الدقيقة.



    In principle, the PCR product thus  generated reflects a mixture of microbial gene signatures from all organisms present in a sample.



PCR amplification of conserved genes such as 16S rRNA” from an environmental sample has been used extensively in microbial ecology primarily because these genes are:

1.    Ubiquitous, i.e., present in all living organisms.

2.    Structurally and functionally conserved , and

3.    Contain variable and highly conserved regions (Hugenholtz 2002).





The PCR products amplified from environmental DNA are analyzedتحليل primarily by :

1.    Clone library method.

2.    Genetic fingerprinting (e.g. TGGE, DGGE, RAPID).

3.    DNA microarray , or by a combination  of these techniques.



1- Clone Library Method

      The most widely used method to analyze PCR products amplified from an environmental sample is to clone and then sequence the individual gene fragments (DeSantis et al. 2007).



The obtained sequences are compared to known sequences in a database such as GenBank, Ribosomal Database Project (RDP), and Greengenes.

      Typically , cloned sequences are assigned to phylum, class, order, family, subfamily, or species at sequence similarity values of 80, 85, 90, 92, 94, or 97%, respectively (DeSantis et al. 2007).

      Despite its limitations (e.g., labor -intensive, time-consuming , and cost factor), clone libraries are still considered the “gold standard” for preliminary microbial diversity  surveys (Descants et al. 2007).






Genetic Fingerprinting Techniques

    Genetic fingerprinting generates a profile of microbial communities based on direct analysis of PCR products amplified from environmental DNA (Muyzer 1999).

    These techniques include DGGE/TGGE, SSCP, RAPD, ARDRA, T-RFLP, LH-PCR, and RISA produce a community fingerprint based on either sequence polymorphism or length polymorphism.





    In general, genetic fingerprinting techniques are rapid and allow simultaneous analyses of multiple samples.



    Fingerprinting approaches have been devised to demonstrate an effect on microbial communities  or differences between microbial communities and do not provide direct taxonomic identities.



       The “fingerprints” from different samples are compared using computer assisted cluster analysis by software packages such as GelCompar, and community relationships are inferred.

       Community fingerprints are scored as present or absent, and the similarities among samples are determined using Jaccards’ coefficient.

Temperature gradient gel electrophoresis (TGGE)

     TGGE and DGGE are forms of electrophoresis which use either  a temperature (T) or chemical gradient (D) to denature  the sample as it moves across an acryl amide gel.



     TGGE and DGGE can be applied to nucleic acids such as DNA and RNA, and (less commonly) proteins.

     TGGE relies on temperature dependent changes in structure to separate nucleic acids.



    DGGE was the original technique , and TGGE a refinement of it.





        DNA has a negative charge and so will move to the positive electrode in an electric field.



      A gel is a molecular mesh , with holes roughly the same size as the diameter of the DNA string .

When an electric field is applied , the DNA will begin to move through the gel , at a speed  roughly proportional  to the length of the DNA molecule — this is the basis for size   dependent separation  in standard electrophoresis.

    However , in TGGE, there is also a temperature gradient across the gel.

    At room temperature, the DNA will exist stably in a double-stranded form.

    As the temperature is increased , the strands begin to separate (melting), and the speed at which they move through the gel decreases drastically



      The temperature at which melting occurs depends on the sequence (GC base pairs are more stable  than AT (there are three hydrogen bonds between a cytosine and guanine base pair, but only two between adenine and thymine)), so TGGE provides "sequence dependent , size independent method " for separating DNA molecules.



      TGGE not only separates molecules, but gives additional information about melting behavior and stability  (Biometra, 2000).





ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ

Denaturing-Gradient Gel Electrophoresis

 (DGGE)

      In “DGGE”, the PCR products are obtained from environmental DNA using primers for a specific molecular marker (e.g., 16S rRNA gene) and electrophoresed on a polyacrylamide gel containing a linear gradient of DNA denaturant such as a mixture of urea and form amide (Muyzer et al. 1993).

    DGGE works by applying a small sample of DNA (or RNA) to an electrophoresis gel that contains a denaturing agent .



    Researchers have found that certain denaturing gels are capable of inducing DNA to melt at various stages.

     وقد  وجد الباحثون أن جل المسخ المحدد قادر على حمل الدنا لتذوب في مراحل مختلفة



    As a result of this melting , the DNA spreads through the gel and can be analyzed for single components, even those as small as 200-700 base pairs.



    What is unique about the DGGE technique is that as the DNA is subjected  to increasingly extreme denaturing conditions , the melted strands fragment completely into single strands

    The process of denaturation on a denaturing gel is very sharp: "Rather than partially melting in a continuous zipper -like manner , most fragments melt in a step-wise process.

    Discrete portions or domains of the fragment suddenly become single-stranded within a very narrow range of denaturing conditions" (Helms, 1990).



    This makes هذا يجعل it possible من الممكنto discern differences تمييز الاختلافات in DNA sequences تسلسل الحمض النويor mutations of various genesطفرات الجينات المختلفة  : sequence differencesالاختلافات في التسلسل  in fragments of the same length في القطع ذات نفس الطول often cause themغالباُ ما يسبب لهم  to partially melt الإذابة الجزئيةat different positionsلمواقع مختلفة  in the gradient الانحدارand thereforeلذلك  "stop" at different positions in the gel.

    By comparing the melting behavior بمقارنة سلوك الذوبان  of the DNA fragments side-by side جنباً إلى جنب on denaturing gradient gelsمسخ الجل المنحدر , it is possible to detectليكشف  fragments that have mutations طفرات in the first melting domain حقل الذوبان الأول (Helms, 1990).

    Placing two samples side-by-side وضع عينتين جنباً لجنب on the gel and allowing them  السماح لهم to denature togetherالمسخ مع بعضهما , researchers can easily see even the smallest differences in two samples or fragments of DNA.

أستطاع الباحثون بسهولة يرون حتى الاختلافات الصغيرة في العينتين أو في القطع من الحمض النووي .



       There are a number of disadvantages هنالك العديد من العيوب to this technique: "Chemical gradients المسخ الكيمياي such as those used مثل تلك المستخدمة in DGGE are not as reproducibleاستنساخه , are difficult to establish  ومن الصعب تحديدهand often do not completely resolveوغالباً لا يمكن تصميمه كاملاً  hetero duplexes" (Westburg, 2001).



      These problems are addressed  هذه المشاكل تعالج by TGGE, which uses a temperature, rather than chemical التي تستخدم درجة الحرارة بدلاً من الكيميائية , gradient to denature the sample.


هناك تعليق واحد:

غير معرف يقول...

رائع جدا
استفدت كثير
الله يجزاك خييييير